absztrakt
A génterápia egyre fontosabbá válik a veleszületett vagy szerzett rendellenességek, például az érelmeszesedés és a rák kezelésében. A várakozások teljesülése előtt azonban jelentős akadályokat kell leküzdeni. A génterápia egyik legkritikusabb területe egy megfelelő, pontos és hatékony génvektor megtervezése, amely biztonságosan beadható in vivo. 12455 Ebben a tanulmányban azt vizsgáltuk, hogy a fókuszált ultrahang használható-e fizikai eszközként a tenyésztett sejtek transzfektálására. in vitro és prosztatarákban koppenhágai patkányokban in vivo .
Ehhez a tanulmányhoz célzott sinus ultrahangot választottunk a lokalizált transzfekcióhoz, mert ez az alkalmazási módszer a legnagyobb transzfekciót mutatta alacsonyabb in vitro citotoxicitással. mérete módosítható.3031 Elvileg az emberi test összes célhelye, amelyhez perkután vagy endoluminális klinikai ultrahang diagnosztikai eszközökkel lehet hozzáférni. Ha a céltérfogat ultrahangos fókuszt bocsát ki, többszörös expozícióval ultrahanggal kezelhető. A célzott szinuszos ultrahang nem közli a transzfekció közvetítését. A munka külön kérdése annak megvizsgálása volt, hogy a célzott sinus ultrahang növelheti-e a riporter plazmid DNS transzfekció hatékonyságát ultrahang intenzitással és nyomáson, alkalmas nem invazív in vivo alkalmazásokhoz, jelentős mellékhatások nélkül.
Ennek érdekében először akusztikus sejttenyésztési kísérletekben optimalizáltuk az akusztikai paramétereket, hogy közvetítsük a β-galaktozidáz és luciferáz riporter gén transzfekcióját több sejtvonalba (NIH 3T3 fibroblasztok, HeLa, R3327-AT1 prosztata adenokarcinóma és Mewo humán melanoma). Ezután az in vivo transzfekció lehetőségét az egyik tesztelt sejtvonalon, az R3327-AT1 prosztata adenokarcinómában tesztelték, amelyet koppenhágai patkányokba transzplantáltak. A citokémiai β-galaktozidáz festést a plazmid tumorba történő közvetlen injektálása és intravénás injekció után hajtottuk végre. Az ultrahang in vivo transzfekciós képességeinek további vizsgálatához ELISA-kat hajtottak végre a β-galaktozidáz riporter fehérje szintjének kvantifikálására a prosztatarákban a riporter gén intratumorális és intravénás beadását követően.
az eredmény
In vitro transzfekció
Először a fókuszált ultrahang in vitro transzfekciós képességeit vizsgálták. A prosztata karcinóma sejtreakciós fiolákat (R3327-AT1) összekevertük egy riporter plazmiddal, és egy víztartályban ultrahangos mezőnek tettük ki, hogy biztosítsuk az egyszerű és optimális ultrahangos kapcsolást (1. ábra). Az optimális ultrahang-transzfekciós körülmények meghatározásához minden 500 ml-es oldatban 1 x 106 prosztatarákos sejtet (R3327-AT1) és 1 μg riporter plazmid DNS-t (β-galaktozidáz) 500 μl PBS-ben alkalmaztunk. Amikor a plazmidmintákat ultrahanggal kezeltük a hangmező fókuszának közepén, a β-galaktozidáz erősen expresszálódott, ami a sikeres DNS-transzfert jelzi. Megállapítottuk, hogy a transzfekciós ráta növekedése 220-szoros stimulációig növekszik a nyomásamplitúdó 0,1 és 1 MPa közötti növekedésével, míg az életképes sejtek százalékos aránya nagyobb nyomásamplitúdók mellett 5% -ra, 5 MPa-ra csökkent (2. ábra). A legjobb ingerlést és a sejtek életképességét tekintve a legjobb arányt 1 MPa-nál, 80% -os életképesség mellett érték el. Ezt a nyomást alkalmazták a következő kísérletekben, mivel a szonikálás ideje változott. A szonikációs idő növekedésével a stimulációs ráta 3 percre nőtt, míg a sejtek életképessége jelentősen csökkent (3. ábra).
Szonikáló készülék vázlata. A fókuszált ultrahangot egy 10 cm-es piezoelektromos lemezérzékelővel állítottuk elő, amelyet polisztirol lencsével fókuszáltunk (fókusztávolság, f = 126 mm), és egy 40 l-es víztartályhoz csatlakoztattuk. A DNS-el kevert sejteket tartalmazó reakció ampullákat szobahőmérsékleten a hangmező ellipszoid fókuszába vagy kívül helyezzük el. Ugyanezt a berendezést használták az in vivo kísérletekhez. A patkányokat egy műanyag csőben tartottuk 45 ° -os szögben, és az alsó testüket egy víztartályba merítettük, hogy a comb daganatait víz alatt ultrahanggal ultrahanggal kezelhessük az ultrahang kapcsolat javítása érdekében. Szonikálás céljából a daganatok közepét a hangmező geometriai fókuszába helyeztük.
Teljes méretű kép
A nyomásamplitúdó hatása az ingerlésre és az életképességre. A β-galaktozidáz riporter plazmid in vitro transzfekciója Dunning prosztatarák sejtekben, fókuszált ultrahanggal vonja alá az R3327-AT1 vonalat. A nyomásamplitúdó hatása a stimulációra és az életképességre normalizálódott a kontrollra, amelyet β-galaktozidáz festéssel és tripán kék festéssel határoztak meg (n = 4, átlag ± se). A génexpressziót 24 órával az ultrahangos kezelés után elemeztük. A ráncstimulációt a kék sejtek számával elosztva a nem sejtes kontrollokban lévő kék sejtek számával. A sejtek életképességét közvetlenül ultrahangos kezelés után elemeztük. A szonikálás ideje 3 perc volt, az impulzus frekvenciája 100 Hz, az impulzus hossza 4 ms.
Teljes méretű kép
A szonikációs idő hatása a stimulációra és az életképességre. A β-galaktozidáz riporter plazmid in vitro transzfekciója Dunning prosztatarák sejtekben, az R3327-AT1 alvonal. A szonikációs idő stimulációra és életképességre gyakorolt hatását a β-galaktozidáz-festéssel és tripán-kék festéssel (n = 4, átlag ± se) festett kontrollhoz normalizáltuk. A génexpressziót 24 órával az ultrahangos kezelés után elemeztük. A ráncstimulációt a kék sejtek számával elosztva a nem sejtes kontrollokban lévő kék sejtek számával. A sejtek életképességét közvetlenül ultrahangos kezelés után elemeztük. A nyomás amplitúdója 1 MPa, az impulzus frekvenciája 100 Hz, az impulzus hossza 4 ms.
Teljes méretű kép
Ezzel szemben azt tapasztaltuk, hogy sem a géntranszfer, sem a sejthalál nem nőtt a kontroll sejtekhez képest a kontroll sejtekhez képest, amikor a plazmid DNS-fiolákat 0,1 MPa-nál kisebb nyomásamplitúdókkal a hangtér fókuszán kívülre helyeztük. A következő paraméterkészletet használtuk a következő kísérletek során (1 MPa nyomásamplitúdó, 100 Hz impulzus frekvencia, 4 ms robbanási idő, 3 perc ultrahangos idő).
A β-galaktozidáz riporter rendszer mellett a luciferáz gént (CMV-luci) használtuk riporterként, hogy megerősítsük az önállóan célzott ultrahang-közvetített in vitro transzfekciót. Miután a luciferáz gént prosztatarákos sejtekbe adtuk be a fentiekkel megegyező körülmények között, és ugyanazt az ultrahangos eljárást alkalmazva, mint amelyet a β-galaktozidáz riporter rendszerhez használtunk (nyomás amplitúdója 1 MPa, impulzus frekvenciája 100 Hz, hossza 4 ms). szonikálás ideje, 10 μg plazmid DNS), a luciferáz aktivitást összehasonlítottuk a kontrollokkal (csak DNS), az ultrahanggal kezelt DNS oldatokkal és a kalcium-foszfáttal transzfektált kontroll oldatokkal (DNS és kalcium-foszfát, ultrahang nélkül). A luciferáz aktivitás szonikálás után 310-szer magasabb volt, mint a nem szonikált kontrolloknál (4. ábra). A standard kalcium-foszfát transzfekciós módszerrel kiváltott luciferáz aktivitás csak nyolcszor magasabb, mint az ultrahang által kiváltott luciferáz aktivitás.
Luciferáz aktivitás célzott ultrahang és CaPo4 után. Az R3327-AT1 sejtek relatív luciferáz aktivitása 24 órával a helyszínen irányított ultrahang-közvetített transzfekció után (USA) a CMV luciferáz plazmid riporter génnel, normalizálva egy észrevétlen kontrollra. Az üvegcséket víztartályban fókuszált ultrahangnak vetettük alá 3 percig szobahőmérsékleten (impulzus frekvencia 100 Hz, repesztés hossza 4 ms, pozitív nyomás amplitúdója 1 MPa). Összehasonlításképpen, a CaPo4 transzfekciós hatékonyságát (n = 4, átlag ± se) jelentik. Az ultrahang által kiváltott transzfekció és a kontroll, valamint a CaPo4 transzfekció és az ultrahang közötti különbségek statisztikailag szignifikánsak voltak (P
Különféle sejtvonalak transzfekciója az Egyesült Államokban. Különböző sejtvonalak koncentrált ultrahang-indukálta stimulációja normalizálódott az egyes kontrollokhoz. Az NIH 3T3 fibroblasztokat, a prosztatadaganat R3327-AT1 alosztályát, az emberi melanoma sejteket (Mewo) és a HeLa sejteket összekevertük a β-galaktozidáz riporter plazmiddal, és 1 MPa pozitív nyomásamplitúdóval szonikáltuk 100 Hz fókusztérben. és 4 ms sorozatidő 3 percig (n = 5, átlag ± se).
Teljes méretű kép
Ennek megfelelő in vitro transzfekciós hatékonyság 2% (HeLa), 4% (NIH 3T3), 12% (R3327-AT1) és 3% (Mewo) volt, a sejtek életképessége 50% (Mewo) és 80% között változott. % (R3327-AT1). Ezért a hangtér fókuszában a transzfekció hatékonyságát indukált ultrahanggal lehetne jelezni.
In vivo transzfekció Dunning R3327-AT1 tumorba
Az in vivo Dunning tumor transzfekciós kísérletek szövettani elemzésének eredményeit a 6. és a 7. ábrán mutatjuk be. Mind a hét R3327-AT1 prosztatarák, amelyet közvetlenül DNS-be injektáltunk és ultrahanggal kezeltünk, pozitív, kék festéssel mutattak ki β-galaktozidáz sejteket. Ezzel szemben a legtöbb (hétből öt) intratumorális DNS-injekcióval ultrahangos kezelés nélkül nem mutatott kék sejteket, és csak két intratumorális DNS-injekcióval rendelkező, de ultrahang nélküli tumor esetében több kék sejt volt látható. Ez a különbség a kéksejtek kimutatásának gyakoriságában a szonikált és a nem szonikált daganatok között statisztikailag szignifikáns volt (P = 0,02, Fisher pontos tesztje). Összehasonlítva a pozitív sejtek szekcióit a pozitív sejtekkel, azt találtuk, hogy az ultrahang 10-szeres növekedést indukált a β-galaktozidáz pozitív sejtek átlagos számában a plazmid DNS intratumorális injektálása után, önmagában a DNS injekcióhoz képest (P
Az R3327-AT1 prosztatarák in vivo transzfekciója. Prosztata tumor R3327-AT1. A β-galaktozidáz aktivitás citokémiai festése egy β-galaktozidáz riporter plazmid (10 μg DNS) közvetlen intratumorális in vivo injektálása után. A daganatokat ultrahangos kezelés után 24 órával reszekcióval rögzítettük, pufferolt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A szöveti szakaszokat (4-6 μm) X-gal pufferrel festettük és ellenfestettük semleges vörös színnel (× 160). Hasonló eredményeket kaptunk mind a hét daganattal, amelyet DNS-sel injektáltunk és ultrahanggal kezeltünk. A DNS-injekció nélküli daganatok és az intravénás DNS-injekcióval rendelkező daganatok nem mutattak kékfestő sejtet.
Teljes méretű kép
Ultrahang által kiváltott transzfekció az R3327-AT1 prosztatarákban in vivo. A β-galaktozidáz pozitív tumorsejtek relatív száma citokémiai festésben kontroll állatokban, csak szonikálás (USA), intratumorális DNS injekció (it), intratumorális DNS injekció és ultrahang (it + USA), intravénás injekció (iv) és intravénás injekció plusz után ultrahang (iv + USA). A normalizált számot nem szonikált daganatokra normalizáltuk, amelyekhez csak a DNS-oldatot injektáltuk (vagyis négy-hat daganat oszlopait használtuk). A pozitív sejtek számának különbsége intratumorális DNS-injekció után ultrahanggal vagy anélkül, statisztikailag szignifikáns volt (P 0, 3, LSD teszt). Azt sem tudtuk ELISA-val bizonyítani, hogy a fókuszált ultrahang a riporter fehérje expressziójának jelentős szintjéhez vezet a tumorokban a plazmid DNS iv. Beadása után (P> 0, 2, LSD teszt).
Ultrahang által közvetített transzfekció in vivo
Az in vivo kísérletekhez ugyanazt a fent leírt ultrahangos készüléket és víztartályt használták. A szonikálás során az érzéstelenített állatokat egy poliakril műanyag csőben fékezték vissza, amelyet a víztartályban helyeztek el az injekciós üvegekhez használt ugyanazon pozicionáló rendszeren keresztül. A víz hőmérsékletét 36 ° C-on tartottuk. A daganatot hordozó lábat a poliakril-jig lyukán keresztül vetítették a vízbe, és egy szál rögzítette. Szonikálás céljából a daganat közepét a hangmező geometriai fókuszában (1. ábra) úgy helyeztük el, hogy az ultrahang terjedésének középtengelye nem zavarta sem az állat testrészeit, sem a be- vagy kilépő műanyag csövet a daganat helye. A kontroll daganatokat ugyanúgy helyeztük el a vízfürdőben anélkül, hogy ultrahanggal kezeltük volna.
A daganatokat 10 μg CMV-LacZ DNS-vel injektáltuk 50 μl PBS-ben 3 perccel az ultrahangos kezelés előtt. Az injekciót a daganat közepére hajtották végre, és a tűt lassan mozgatták az injekció során, hogy biztosítsák a széles eloszlást és elkerüljék az intratumorális vérzést vagy a mechanikus tumorváltozásokat. Annak elkerülése érdekében, hogy a daganat turgora miatt a kanülön keresztül szivárogjon a DNS-oldat, elővizsgálatokkal teszteltük a legjobb módot az intratumorális injekció végrehajtására. Megállapítottuk, hogy ha a tű 2-3 percig mozdulatlan marad a tű eltávolítása előtt, az oldat a daganatban marad. Intravénás alkalmazáshoz 100 μg CMV-LacZ DNS-t 500 μl PBS-ben injektáltunk az állat farokvénájába 3 perccel a szonikálás előtt.
A citokémiai analízishez a daganatokat ultrahangolás után 24 órával reszekcióval rögzítettük, pufferelt formalinban rögzítettük és paraffinba ágyazottuk. A szövetszeleteket (4–6 μm) festettük X-gal pufferrel, és ellenfestettük semleges vörös színnel. A stimulációt a szövettani szeleteken lévő kék sejtek rács segítségével történő számlálásával értékeltük. Összehasonlítottuk a megfelelő 5 mm 2 -es reprezentatív területeket, ahol az egyes szeleteken a legtöbb kék sejt detektálható volt. Citokémiai festéssel különbségeket észleltünk a transzfektált sejtek számában, valamint a génexpressziós terület helyében és geometriájában.
Három további daganatot csak ultrahanggal kezeltünk, 72 órával a kezelés után reszekcióval kezeltük és hematoxilin-eozinnal (HE) festettük.
A béta-galaktozidáz fehérje koncentrációt ELISA (3 Prime-5 Prime, Boulder, CO, USA) alkalmazásával számszerűsítettük a gyártó utasításainak megfelelően. Ugyanazt a biológiai modellt, ultrahang-körülményeket és plazmid-alkalmazásokat alkalmaztuk, mint a szövettan esetében, egy másik kísérletet is elvégeztünk. A daganatokat ultrahangos kezelés után 24 órával összegyűjtöttük és folyékony nitrogénben lefagyasztottuk. Összehasonlításképpen, ezeknél az állatoknál a daganatot borító bőrt, valamint a daganattal szomszédos combizom darabot is elemeztük. A szöveteket porrá őröltük és sejtlizátumokat készítettünk lízispuffer segítségével (10 mM Tris-Cl, pH 8, 1 mM PMFS, 1 μg/ml Aprotinin). A szöveti törmeléket 14000 g-os centrifugálással ülepítettük, és a teljes fehérjekoncentrációt Bradford-esszével (BioRad Laboratories, Richmond, CA, USA) határoztuk meg. Az abszorbancia értékeket 405 nm hullámhosszúságú ELISA lemezolvasó alkalmazásával számszerűsítettük. A β-galaktozidáz fehérje mennyiségét ng β-galaktozidáz/milligramm fehérje mennyiségben határoztuk meg. Az összes szövetmintát három példányban mértük.
Statisztikai analízis
Fisher pontos tesztjét használtuk az arányok elemzéséhez, és Student's t-tesztet használtunk az átlagok összehasonlításához. Többszörös összehasonlításhoz varianciaanalízist (ANOVA) alkalmaztunk Fisher legkevésbé szignifikáns különbség (LSD) módszerével. Általánosságban elmondható, hogy az in vitro minta mérete négy-öt minta volt minden állapotban, az in vivo minta mérete pedig négy-hét tumor volt állapotonként. Valamennyi elemzést a Statistica 5.0 szoftverprogrammal végeztük, 43 és minden teszt kétfarkú volt.
köszönöm
Köszönetet mondunk Juergen Jenne-nek a fizikai ultrahangmérésekben nyújtott támogatásért, Peter Peschke-nek az AT1-sejtek és a szövettani elemzések támogatásáért, Klaus Weber-nek a Mewo-sejtek biztosításáért és Juergen Debus-nak a vizsgálatok támogatásáért. Köszönjük Alexandra Tietzének az állatkísérletekben nyújtott kiváló technikai segítséget. Köszönetet mondunk Thomas Wirthnek a projekt megbeszéléséért, riporter konstrukciók, valamint az NIH 3T3 és HeLa sejtek biztosításáért. Ezt a munkát részben a Deutsche Forschungsgemeinschaft támogatta (Hu 798/1-1).