- absztrakt
- A fő
- ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
- Betegcsoportok
- Polimeráz láncreakció (PCR)
- A restrikciós fragmens hosszának polimorfizmus elemzése
- Statisztikai analízis
- AZ EREDMÉNYEK
- A népesség jellemzői
- A genotípusok és az OR gyakorisága
- VITA
absztrakt
Cél: A nyelőcső adenokarcinóma és annak prekurzor elváltozása iránti genetikai hajlam a Barrett-nyelőcsőre még nem teljesen tisztázott. Ez a tanulmány a polimorfizmusok hatását vizsgálta a mangán szuperoxid-diszmutáz (MnSOD) és a NAD (P) H gének: kinon-oxidoreduktáz 1 (NQO1) génjeiben a Barrett-nyelőcső vagy a nyelőcső-adenokarcinóma kialakulásának kockázatának modulálásában.
Módszerek: Összesen 584 beteget (146 nyelőcső, 200 Barrett-nyelőcső, 144 adenokarcinóma-nyelőcső és 94 kontroll) genotipizáltunk MnSOD C14T és NQ01 C609T polimorfizmusokra polimeráz láncreakcióval és restrikciós fragmens hosszának polimorfizmus elemzésével.
Eredmények: Az NQO1 TT genotípus ritkábban fordult elő Barrett-nyelőcsőben (2,0%) és nyelőcső-adenokarcinómában (1,4%) szenvedő betegeknél, összehasonlítva a nyelőcsővel (7,6%) és a kontrollokkal (5,4%). A nem, az életkor, a testtömeg-index, a reflux tünetek és a dohányzás kiigazítása után a homozigóta TT 4 genotípusú betegeknél 5,5-szer csökkent a Barrett-nyelőcső kialakulásának kockázata (valószínűség = 0,22, 95% -os konfidencia intervallum = 0,07-0,76, P = 0, 01) és 6, kétszerese csökkentette a nyelőcső adenokarcinóma kockázatát (valószínűségi arány = 0, 16, 95% konfidencia intervallum = 0, 03–0, 94, P = 0,04), összehasonlítva a TC és CC genotípusú egyénekkel. Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a csoportok között az MnSOD polimorfizmus szempontjából (P = 0,289).
Következtetések: Összességében ennek a tanulmánynak az eredményei arra utalnak, hogy az NQO1 TT genotípus védelmet nyújthat olyan reflux szövődmények ellen, mint a Barrett-nyelőcső és a nyelőcső-adenokarcinóma.
A fő
A legtöbb nyelőcső-adenokarcinóma (EAC) egy többlépcsős út utolsó szakaszaként merül fel, amely a nyelőcső nyálkahártyájának egy szakaszában metaplasztikus változással kezdődik, amely állapot Barrett nyelőcsőjének (BE) nevezik. 1 Ebben a premalignus fázisban a pluristratifikált nyelőcsőhám bélszerű oszlopos jellemzőkre tesz szert, beleértve a serlegsejtek jelenlétét is. 2 Az elmúlt 30 év során számos epidemiológiai tanulmány ok-okozati összefüggést állapított meg a gasztro-oesophagealis reflux betegség (GERD), valamint a BE és az EAC kialakulása között, a kockázat fokozódik azoknál az egyéneknél, akiknél a legsúlyosabb, a reflux időtartama és gyakorisága a legnagyobb. 3, 4 A reflux, valamint a BE és az EAC kockázata közötti egyértelmű kapcsolat ellenére a GERD-ben szenvedő betegek csak kisebb részénél jelentkeznek reflux-függő szövődmények, és a BE-betegek csak 0,5% -ánál alakul ki évente rák. 5 Eddig tisztázni kell a refluxra adott válasz heterogenitásának okait.
Tekintettel erre a mutagén refluxpotenciálra, a GERD és a BE eredmények heterogenitása összefüggésbe hozható az antioxidáns, a méregtelenítés és a DNS-helyreállítási utak egyéni variációival, amelyek befolyásolhatják a BE rosszindulatúvá válásában megfigyelt genetikai változások megszerzésének kockázatát. vizsgálták a specifikus genetikai polimorfizmusok és a nyelőcső laphámsejt közötti összefüggést magas kockázatú ázsiai populációkban. 15–19 Mindazonáltal mind a mai napig csak néhány jelentés jelent meg az EAC genetikai hajlamáról a nyugati országokban; a BE iránti genetikai fogékonyság szerepével egyre inkább foglalkoznak.
Ebben a tanulmányban megvizsgáltuk a genetikai polimorfizmusok szerepét a mangán-szuperoxid-diszmutázokban (MnSOD) és a NAD (P) H: kinon-oxidoreduktáz 1-ben (NQO1) a BE és EAC iránti érzékenység modulálásában a brit populációban. Az MnSOD-ot azért választották ki a kutatáshoz, mert ez az enzim fontos antioxidáns védelmet nyújt a gyulladásos folyamatok során keletkező szuperoxid-anionokkal szemben. 8, 20 Az MnSOD C14T polimorfizmus az alanin aminosav (C allél) valinná (T allél) változását eredményezi a szignálpeptidben, amely felelős az érett fehérje megfelelő 21, 22 szubcelluláris helyre történő transzportjáért, és összefüggésben van a különféle rákos megbetegedések. A II. Fázisú NQO1 méregtelenítő enzimet azért választották, mert számos természetes és szintetikus vegyülettel reagál, ideértve a kinonokat, a kinon-epoxidokat, a kinonimint, a naftoquinonokat, a metilénkéket, az azo- és a nitrovegyületeket 28, és ezért sokféle anyagot képes metabolizálni. a refluxban található rákkeltő anyagok. A TT genotípus nulla fenotípusnak felel meg, mert csökkent aktivitású és meghosszabbított felezési idővel rendelkező mutált fehérje termeléséhez vezet. 29 Korábbi vizsgálatok összefüggést mutattak e polimorfizmus és számos rák között, beleértve a gasztro-nyelőcső rosszindulatú daganatait is. 30, 31
Vizsgálatunk eredményei azt sugallják, hogy az NQ01 C609T polimorfizmus módosíthatja annak valószínűségét, hogy a gasztro -ophagealis refluxban szenvedő betegeknél BE és EAC alakul ki, míg az MnSOD C14T polimorfizmus és e betegségek kockázata között nem találtak összefüggést.
ANYAGOK ÉS METÓDUSOK
Betegcsoportok
A tájékozott beleegyezés nyomán 2000 és 2003 között 584 beteget vettek fel az Egyesült Királyság Yorkshire-i kórházába két felsőoktatási referenciaközpont (Royal Hallamshire Hospital, Sheffield és Leeds General Infirmary, Leeds) speciális diszpepsziás és Barrett Endoscopy Klinikájára. A toborzáskor információkat gyűjtöttek az életkorról, a nemről, a reflux tünetekről, a testtömeg-indexről (BMI), a dohányzásról, az alkoholfogyasztásról és a gyógyszeres kezelésről. A DNS-t kivontuk vérből (n = 470) vagy normál nyelőcső biopsziás mintákból (n = 114) fenol/etanol módszerrel vagy TriReagent kit (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, Egyesült Királyság) alkalmazásával.
Polimeráz láncreakció (PCR)
Az NQ01 C609T és MnSOD C14T polimorfizmusok genotipizálását PCR-rel és korlátozott hosszúságú fragmensek polimorfizmus-analízisével végeztük, amint azt korábban leírtuk, 23, 30, kisebb módosításokkal. Röviden: 1 μl DNS-t amplifikáltunk 1x PCR pufferrel (Qiagen Ltd., Crawley, Egyesült Királyság), 12,5 pmol előre és reverz primerekkel (InVitrogen Ltd., Paisley, Egyesült Királyság), 0,5 egység HotStarTaq DNS polimerázzal (Qiagen Ltd.) és 200 μM dezoxiribonukleozid-trifoszfát (InVitrogen Ltd.), 20 μl össztérfogatban, egy GeneAmp PCR System 2700 termociklerrel (Applied Biosystems, Warrington, Egyesült Királyság). A primer szekvenciák 5'aagcccagaccaacttct3 'és 5'atttgaattcgggcgtctgctg3' voltak az NQ01 esetében, és 5'accagcaggcagctggcgccgg3 'és 5'gcgttgatgtgaggttccag3' az MnSOD esetében. A reakció körülményei 15 percig 95 ° C-on voltak a HotStarTaq aktiválásához, majd 38 ciklus 30 másodpercig 95 ° C-on, 30 másodpercig 60 ° C-on és 30 másodpercig 72 ° C-on, és 7 percig végső meghosszabbításig 72 ° C-on. Minden egyes amplifikációs tételben kontroll mintákat vontunk be, amelyekből a DNS-t kihagytuk. A PCR reakció sikerességét és a keresztszennyeződés hiányát a negatív kontrollokban 1,5% -os agarózgél-elektroforézissel ellenőriztük. A PCR-termékek várható mérete 174 bp volt az NQ01 esetében és 107 bp az MnSOD esetében .
A restrikciós fragmens hosszának polimorfizmus elemzése
Tíz mikroliter PCR-terméket emésztettünk egy éjszakán át 37 ° C-on, 5 egység HinfI (NQ01) vagy NgoM IV (MnSOD) (New England Biolabs Ltd., Hitchin, Egyesült Királyság) 20 μl össztérfogatban. A genotípusokat 3% -os (NQ01) vagy 4 (MnSOD) agarózgél-elektroforézissel tettük láthatóvá a PCR termék 0,5x etilén-diamin-tetraecetsav-triszborát-pufferben, amely 0,5 μg/ml etidium-bromidot tartalmazott (Sigma-Aldrich Ltd., Gillingham, Egyesült Királyság). Az NQ01 polimorfizmus szempontjából a C allélt 174 bp sávként jelenítettük meg, míg a T allélt két 122 és 52 bp méretű fragmensre hasítottuk (1. ábra). Az MnSOD polimorfizmus T alléljét egy kezeletlen 107 bp termékkel azonosítottuk, míg a C allél két 89 és 18 bázispár méretű fragmenst eredményezett (2. ábra). Miután a helyes genotípust szekvenálással megerősítettük (GRI Genomics, Rayne, Egyesült Királyság), a három genotípus mindegyikéhez egy-egy mintát vittünk be minden amplifikációs és emésztési tételbe minőség-ellenőrzésként. A genotipizálást a minták 10% -ánál megismételtük, és minden esetben következetes eredményeket mutattak.
Az NQ01 C609T genotípusok 3% -os agarózgél-elektroforézissel láthatóak. A C allél 174 bp sávként jelenik meg, míg a T allélt két 122 és 52 bp fragmentum jelzi. A, CC vezérlés; B, CT vezérlés; C, TT vezérlés; N, ellenőrizze lemez nélkül; M, létra 100 bp. A tetején lévő számok az egyes egyedek emésztett PCR-termékét jelzik.
Teljes méretű kép
4% agaróz gél elektroforézissel detektált MnSOD genotípusok. A T allélt 107 bp emésztetlen töredékként vizualizálják, míg a C allélt két 89 és 18 bp fragmentum jelöli. A, CC vezérlés; B kontroll, TT; C, CT kontroll; M1 és M2 létra, 100 bp; N, ellenőrizze sablon nélkül. A tetején lévő számok az egyes személyek emésztett PCR-termékét jelzik.
Teljes méretű kép
Statisztikai analízis
A kategorikus változók (férfiak/nők neme, soha/soha nem dohányzók) különbségeit a vizsgálati csoportok között a Pearson test 2 teszt segítségével értékeltük. A folyamatos változók (életkor, BMI és alkoholfogyasztás) összehasonlítására Kruskal-Wallis tesztet használtak, mivel ezek a változók nem egyeztek a normális eloszlással, amint azt a Kolmogorov-Smirnov teszt is jelzi. A specifikus genotípusokhoz tartozó tanfolyamarányokat (OR) és 95% -os konfidenciaintervallumokat (CI) többféle logisztikai regresszió alkalmazásával számítottuk ki, nem, életkor, BMI, reflux és dohányzási állapot kiigazításával és anélkül. A statisztikai elemzést az SPSS 12.0 szoftver (SPSS Inc., Chicago, IL) és a STATA 7 (STATA Corporation, College Station, TX) alkalmazásával végeztük. Ezenkívül a genotípus frekvenciákat Hardy-Weinberg egyensúly szempontjából teszteltük a 2. jó állapot teszt segítségével (Graphpad Instat, 2, 05). P 0,05), kivéve a nyelőcsőgyulladásban szenvedő betegek NQ01 polimorfizmusát (P = 0,005). Nem figyeltünk meg szignifikáns különbséget a genotípus gyakoriságában az MnSOD polimorfizmusban (P = 0,289) a csoportok között (2. táblázat). Ezzel szemben az NQ01 C609T polimorfizmus gyakorisága (P 0, 500) (3. táblázat).
Asztal teljes méretben
Asztal teljes méretben
VITA
A reflux tünetei gyakoriak a nyugati populációkban, 34, 35, de amikor ezeket a betegeket endoszkópiára helyezik, néhányuknak nincs látható patológiája, van, akinek nyelőcsőgyulladása alakult ki, másoknak pedig a BE rákot megelőző elváltozása alakult ki, amely fokozott rizikóval jár együtt. az EAC-ba való progresszió. Az EAC prognózisának korai diagnózissal történő javítása érdekében az American College of Gastroenterology azt javasolja, hogy az összes BE-pácienst vonják be endoszkópos nyomonkövetési programokba. 37 Azonban a genetikai markerek kifejlesztése azon BE-betegek egy részének azonosítására, akiknél nagyobb a valószínűsége a rák kialakulásának, lehetővé tenné a felügyelet kifejezetten a magasabb kockázatú egyének számára történő megcélzását. E tanulmány célja tehát annak értékelése volt, hogy a szabad gyökök védekezésével és az xenobiotikus méregtelenítéssel kapcsolatos gének genetikai polimorfizmusai hozzájárulhatnak-e a heterogenitáshoz a nyelőcső patológiájának kialakulásában, és felhasználhatók-e a progresszió magasabb kockázatának mutatóiként.
Vizsgálatunk eredményei összhangban vannak a korábbi kutatások eredményeivel, amelyek a nulla T allél hasonló védőhatását mutatják a tüdőrák T polimorfizmusa ellen, csökkentett tüdőrák kockázatával. Cancer Res 1999; 59: 3045–3048. "Href =/articles/gim200757 # ref38 aria-label =" 38. referencia "adatnyom = kattintás adatnyom = link> 38-41, valószínűleg az NQO1 rákkeltő anyagokra gyakorolt csökkentett aktiváló hatása miatt 41 Más kutatások azonban azt sugallják, hogy az NQ01 csökkenése a T allélhez kapcsolódó aktivitás hajlamosíthat a gyomor, a vastagbél, a hólyag, a méhnyak, a 44 és az emlő rákos megbetegedéseire. Ennek a polimorfizmusnak a különböző rosszindulatú daganatokban mutatkozó látszólagos kontrasztos szerepe tükrözheti az NQ01 karcinogén anyagcserére gyakorolt komplex hatását és annak képességét. antioxidáns és prooxidatív aktivitás egyaránt., 46 NQ01 méregteleníti a mérgező kinonokat, például néhány benzolszármazékot, redukciójuk stabilabb és könnyebben hozzáférhető kiválasztott hidrokinonokká katalizálásával. Más anyagok metabolizmusa azonban olyan intermedierekhez vezethet, amelyek szabad gyököket vagy alkilezőszereket generálhatnak Az élelmiszerekben található néhány nitrozovegyületet és a benzinben található toxikus anyagokat például az NQ01, 29, 46 aktiválja.
Ami az NQ01 szerepét illeti a nyelőcső karcinogenezisében, egy tanulmányban a TT genotípus a laphámsejt megnövekedett kockázatával társult. 31 A nyelőcső pikkelyes sejtes karcinómában a magas NQ01 aktivitás védőhatása és az EAC-ra hajlamosító szerepünk közötti ellentét tükrözheti a nyelőcsőrák e két szövettanilag eltérő típusának eltérő etiológiáját. Például az NQ01 aktiválhat olyan specifikus rákkeltő anyagokat, amelyek kizárólag az EAC kifejlesztésében vesznek részt, például a refluxban található exogén és endogén vegyületeket. A nitrozovegyületek elfogadható célpontot jelenthetnek ennek az aktivációnak, tekintettel a BE és az EAC kialakulásában betöltött szerepükre. 12-14
Eredményeinkkel ellentétben az NQ01 T allél EAC-re gyakorolt hajlamosító hatását már egy kis tanulmányban javasolták, amely 61 EAC-esetet tartalmazott, 30 bár egy későbbi, ugyanattól a csoporttól kapott nagyobb tanulmány nem erősítette meg ezeket a korábbi megállapításokat. 47 A von Rahden és munkatársai által végzett vizsgálat hiánya annak a ténynek tudható be, hogy vizsgálatuk során az EAC-eseteket egészséges, nem reflux önkéntesekkel hasonlították össze. Mint fent említettük, a TT genotípus védőhatása csak a refluxban lévő prokarcinogén jelenlétében mutatható ki. Ezen eltérések miatt azonban az NQ01 polimorfizmus szerepét a nyelőcső karcinogenezisében további kutatásokban meg kell tisztázni. Különösen érdekes lenne megerősíteni, hogy ez a polimorfizmus befolyásolja-e a BE és az EAC progressziójának valószínűségét egy nagy prospektív vizsgálat keretében, amely krónikus reflux tüneteiben szenvedő betegeket vont be.
Vizsgálatunk során megvizsgáltuk az MnSOD szabad gyökök megsemmisítőjét kódoló gén polimorfizmusát is. Ez az enzim döntő szerepet játszik a szabad gyökök elleni védekezésben azáltal, hogy katalizálja a szuperoxid gyökök hidrogén-peroxiddá történő eltávolítását, amelyet aztán katalázok és peroxidázok vízzé alakítanak. Egy nemrégiben készült jelentés azt mutatta, hogy az EAC kialakulása során a nyelőcsőben az MnSOD szintje megváltozik, 48 megerősítve ennek az enzimnek a nyelőcső karcinogenezise elleni lehetséges fontos védő szerepét. Az itt vizsgált C – T polimorfizmus az alanin helyettesítését eredményezi az MnSOD fehérje 14. pozíciójában valinnal, ezáltal megváltoztatva az érett fehérje transzportjának hatékonyságát a helyes szubcelluláris lokalizációig. 21, 22 Ennek eredményeként kimutatták, hogy ez a polimorfizmus számos rosszindulatú daganatra való hajlamot módosít, ideértve az emlőrákot, a 23, 24 petefészket, a 25 hólyagot, a 26-ot és a tüdőt 27. Bár állatkísérletek kimutatták, hogy a SOD beadása csökkentheti a reflux által közvetített nyelőcső károsodását, eredményeink azt sugallják, hogy az MnSOD C14T helyén található genotípusnak nincs jelentős hatása a reflux okozta szövődmények, például a BE vagy az EAC kockázatára. egy kisebb hatás, amely nagyobb vizsgálatokban is megfigyelhető volt.
A nyelőcsőgyulladás és a BE gyakori megállapítás a reflux tüneteiben szenvedő betegeknél, és endoszkópiára ajánlott (37, illetve 23%). Mivel ebben a vizsgálatban mind a betegeket, mind a kontrollokat diszpepsziából és a Barrett Endoszkópos Klinikából vették fel, tanulmányunk fő erőssége, hogy minden beteg endoszkópos vizsgálaton esett át, hogy lehetővé váljon a megfelelő vizsgálati csoportba történő felvétel. Ennek eredményeként azonban tanulmányunkat korlátozza a felvett betegek viszonylag kis száma, ami azt jelenti, hogy ennek a polimorfizmusnak a nyelőcső karcinogenezisében betöltött szerepét egy nagyobb vizsgálat keretében tovább kell tisztázni. Ezen túlmenően, bár eredményeink azt sugallják, hogy az NQO1 TT genotípus védhet az EAC-ba történő progresszióval szemben, genetikai markerként történő kifejlesztése az alacsonyabb progressziós kockázatú betegek azonosítására lehetetlennek tűnik, mivel betegségtől mentes egyéneknél alacsony ez a genotípus % -5,4%).
Összefoglalva, eredményeink azt sugallják, hogy az NQ01 C609T polimorfizmusok szerepet játszhatnak a GERD-ben szenvedő betegek érzékenységében a reflux szövődmények iránt, és hogy a T-allélos betegeknél kisebb a kockázata a BE és EAC progressziójának. Nagyobb kutatásra van szükség ezen megállapítások megerősítéséhez és a genetikai polimorfizmus és a specifikus expozíciók vagy a kapcsolódó gének polimorfizmusai közötti kölcsönhatások vizsgálatához.