absztrakt
A CÉL: Jelen tanulmányunkban arra a kérdésre kerestük a választ, hogy van-e gyermekkorban az apoptózis-protein-2 (cIAP2) celluláris inhibitorának depó-specifikus expressziója, és a relatív expresszió az életkor előrehaladtával párhuzamosan változik-e a visceralis adipozitás növekvő kockázatával.
Tárgyak: A humán omentális (OM) és a szubkután (SC) zsírszövet párosított mintáit 23 betegből (12 gyermek és 11 felnőtt) kaptuk.
MÓDSZER: A cIAP2 MRNS szintjét reverz transzkripciós polimeráz láncreakcióval (RT-PCR) és a fehérje expresszióját Western-blot segítségével igazoltuk. Az apoptózis-indexeket a dUTP-fluoreszcein-nikkel-vég terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített jelölésével határoztuk meg (TUNEL).
AZ EREDMÉNYEK: A cIAP2 mRNS 1,5-szer magasabb volt az OM-ben, mint az SC zsírszövet (OM> SC 23 alany közül 20-ban; P SC 10 alany közül kilencben, P 1
Az elhízást a zsírszövet súlyának növekedése jellemzi. A testzsír súlya, különösen a zsigeri zsír felhalmozódása szorosan összefügg az inzulinrezisztenciával, a szív- és érrendszeri betegségekkel, a magas vérnyomással és más főbb anyagcserezavarokkal. 2 Ez hangsúlyozta a nem csak a zsír, hanem a zsíreloszlást is szabályozó genetikai tényezők azonosításának fontosságát.
Ismeretes, hogy az omentális (OM) és a szubkután (SC) adipocyták különböző metabolikus tulajdonságokban különböznek, szabályozva a zsírsejtek térfogatát. Úgy tűnik, hogy az emberi zsírsejtek replikációját, differenciálódását és apoptotikus válaszát az anatómiai régió befolyásolja. 5, 6. A zsírszövet eloszlása tehát e folyamatok szabályozásának helyspecifikus különbségéből származhat. A közelmúltban bebizonyosodott, hogy a regionális jellemzők összefüggésben lehetnek a fontos funkcionális fehérjéket kódoló gének expressziójának helyspecifikus különbségeivel. Például a leptin és a PPAR y expressziója magasabb az SC-ben, mint a zsírszövet OM-je. Ezzel szemben az inzulinreceptor expresszió (Ex 11 -) magasabb az OM-ben az SC zsírszövethez képest. 9.
A fehérje apoptózis-2 (cIAP2) celluláris inhibitora az apoptózis fehérjék (IAP) inhibitorcsaládjának tagja, amely részt vesz az apoptózis szabályozásában a sejtproliferáció és a differenciálódás során. Az IAP szerepe az emberi zsírszövetben nem világos, de egyre több bizonyíték azt sugallja, hogy szerepet játszhat a testzsír-eloszlás szabályozásában a zsírsejt-apoptózis modulálásával. Egy jelentés kimutatta, hogy a 3T3-L1 zsírsejtekben a neuronális apoptózis gátló fehérje (NAIP) differenciálódástól függő expressziója korrelálhat az adipocita apoptózissal szembeni rezisztenciájának kialakulásával. Két másik tanulmány arról számolt be, hogy a cIAP2 mRNS depó-specifikus módon expresszálódik felnőtt humán adipocitákban. 14, 15
A génexpresszió különbségének kutatása eddig a felnőttekre összpontosított. Nagyon keveset tudunk a gén expresszióról a gyermekek zsírszövetében. Mivel az emberi zsírszövet súlya és eloszlása tekintetében életkorral kapcsolatos különbségek vannak, arra a kérdésre kerestük a választ, hogy vajon gyermekkorban létezik-e depó-specifikus cIAP2 expresszió, és ha igen, ha a relatív expresszió az életkorral párhuzamosan, a növekedéssel párhuzamosan változik dózis. a zsigeri zsírosság kockázata. Ebben a tanulmányban ezért összehasonlítottuk a cIAP2 expressziós szinteket mind az mRNS, mind a fehérje szintjén az OM és SC zsírszövetekben gyermekeknél és felnőtteknél. Ezenkívül megvizsgáltuk a cIAP2 expressziós szintek és az adipocita apoptózis mértéke, a testtömeg-index (BMI) és a nem közötti kapcsolatot.
mód
Témák és mintavétel
RNS előállítás és RT-PCR
A CIAP2 mRNS szintjét minden olyan alanyban meghatároztuk, akinél az SC és az OM zsírszövetéből származó teljes RNS rendelkezésre állt. A teljes RNS-t TRIzol Reagent (Invitrogen life technologies, CA, USA) alkalmazásával állítottuk elő a gyártó protokollja szerint. Az RNS-t spektrofotometriásán kvantifikáltuk. Az RNS integritását a riboszomális RNS sávok etidium-bromiddal való festésével 1% agaróz gél alkalmazásával ellenőriztük. A kapott RNS-t felhasználásig -70 ° C-on tároltuk.
RT-PCR-t végeztünk a cIAP2 mRNS elemzéséhez. Az összes RNS-t (0,5 ∼ 1 μg) reverz átírással 1 órán át 42 ° C-on 20 μl pufferben, amely 200 U MMLV reverz transzkriptázt, 0,5 μg Oligo d (T) 16, 0,5 mmol/l dNTP-t tartalmaz, kiegészítő DNS (cDNS) mintákat tartalmaz 5 percig denaturáltuk 95 ° C-on, és mindegyik mintából 5 μl cDNS-t alkalmaztunk a későbbi PCR-amplifikációhoz 50 μl puffer végső térfogatában, amely 2,5 U Taq DNS-polimerázt tartalmaz, 2 mmol/l. dNTP-k, 2,5 mmol/l MgCl2 és 0,4 μmol/l mindegyik primer. A PCR-körülmények 95 ° C-on voltak 5 percig, majd 30 ciklus 94 ° C-on 30 másodpercig, 60 ° C-on 45 másodpercig és 72 ° C-on 1 percig, végül 72 ° C-os hosszabbításig további 10 percig. RT-reagenseket a Promega Corp. szállított. (Madison, USA). A PCR reagensek a Roche-tól (Mannheim, Németország) származnak. Két láncindítót alkalmaztunk egyidejűleg ebben a szemikvantitatív RT-PCR-ben (1. táblázat). Különböző számú PCR-ciklust alkalmaztunk annak biztosítására, hogy a cIAP2 és a β-aktin cDNS-amplifikációja egyaránt exponenciális tartományban legyen. Minden PCR-amplifikáció hatodik körében hozzáadtuk a β-aktin primereit.
Asztal teljes méretben
Az amplifikációt követően 10 μl keveréket elválasztottunk 1,5% -os agarózgélen, amelyet etidium-bromiddal festettünk. A géleket UV fényben tettük láthatóvá, a sűrűséget, valamint a cIAP2 és a β-aktin arányát megmértük és elemeztük a Quantitation szoftver segítségével, 4-es verziójú Windows és Macintosh (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).
Fehérje izolálás és Western blot elemzés
Apoptózis kimutatása
15 párosított mintában apoptotikus adipocitákat detektáltunk a dUTP-fluoreszcein-nikkelvég (TUNEL) terminális dezoxinukleotidil-transzferáz által közvetített jelölésével a gyártó protokollja szerint. Apoptotikus indexeket kaptunk 200 adipocita megszámlálásával legalább négy látómezőben fénymikroszkóp alatt.
Statisztikai analízis
Az adatokat a Social Science Statistical Package (SPSS) segítségével elemeztük, és P értékük 0,05-nél kisebb értéket kapott. Mivel a zsírszövetben a cIAP2 expressziója nem volt normálisan elosztva, ezeket a szövegben és a táblázatban mediánként (interkvartilis tartomány) mutatjuk be. Aláírt rangú Wilcoxon-tesztet használtunk az SC és OM expressziós különbségeinek összehasonlítására; A gyermekek és a felnőttek közötti depó-specifikus különbségek összehasonlítására Mann-Whitney-tesztet használtak. A korrelációkat Spearman korrelációs együttható tesztjével számoltuk ki.
az eredmény
Az SC és OM zsírszövetből származó cIAP2 mRNS-expresszió páros összehasonlítását RT-PCR-rel számszerűsítettük az 1.a ábra szerint. Jelentős eltérés mutatkozott az egyének közötti expresszió szintjén, különösen az OM esetében (1b. Ábra). Ennek ellenére szignifikáns depó-specifikus különbség volt a cIAP2 mRNS expresszió szintjében (2. táblázat). A cIAP2 mRNS 1,5-szer magasabb volt az OM-ben az SC zsírszövethez képest (OM> SC 23 alany közül 20-ban; P
Depó-specifikus különbségek a cIAP2 mRNS expressziójában. a) Példa agaróz gélanalízisre öt egyénből származó párosított SC és OM zsírszövet minták RT-PCR után. (b) A szóródiagramok azt mutatják, hogy a cIAP2 mRNS expresszió minden egyén SC és OM zsírjában. A vízszintes sávok jelzik a mediánt.
Teljes méretű kép
Asztal teljes méretben
A Western blotokat a 2. ábra mutatja. Az mRNS expressziójával összhangban a cIAP2 fehérje szintje magasabb volt az OM-ben az SC-hez képest (10-ből kilenc alany közül OM> SC, P
Depó-specifikus különbségek a cIAP2 fehérje expressziójában. (a) Példa négy egyed SC és OM zsírszövetéből származó cIAP2 fehérjék immunblotjaira. (b) A szóródási ábrák cIAP2 fehérje expressziót mutatnak 10 egyed SC és OM zsírjában. A vízszintes sávok jelzik a mediánt.
Teljes méretű kép
Az immunhisztokémiai analízis nem mutatott különbséget az SC és OM között az adipociták apoptotikus indexeiben (14. apoptotikus indexek, amelyek magasabb cIAP2 mRNS expressziót mutattak OM-ben, mint felnőtt SC adipocytákban. Vizsgálatuk azonban csak az mRNS szintjére koncentrált, mert az mRNS expressziója nem mindig tükrözik a fehérje expresszióját vagy a teljesen feldolgozott fehérje koncentrációját, kiterjesztettük a megfigyelést azzal, hogy megerősítettük, hogy az OM és az SC zsírszövet közötti fő különbség a fehérje szintjén is előfordul.
A CIAP2-t eredetileg a TNF-receptor jelátviteli komplexhez kötődő fehérjeként azonosították, ami arra utal, hogy részt vehet a TNFα jelátvitel szabályozásában. Az emberi cIAP2 fehérje túlzott expressziója elnyomhatja a különféle ingerek által kiváltott sejthalált. Humán izolált adipocitákkal összehasonlítva a szérumtartalmú táptalajban tenyésztett preadipociták magasabb cIAP2 mRNS-szinttel rendelkeznek, valamint alacsonyabb érzékenységet mutatnak a TNFα által indukált apoptózisra. 14., 15., 17. Ezért a cIAP2 expressziója SC és OM zsírszövetben tükrözheti a depó-specifikus hajlamot az apoptózisra, és ezáltal a zsírszövet veszteségére vagy lerakódására.
Az emberi zsírszövet növekedése és eloszlása nagymértékben függ az életkortól és a nemtől. A helyspecifikus zsírsejtek korai életkorban történő felhalmozódása hozzájárulhat a depó-specifikus zsírraktárak későbbi lerakódásához. Számos megfigyelés azt sugallja, hogy az elhízás a fejlődés kritikus periódusaiban van programozva, például a korai gyermekkorban az adipozitás felnőttkorban rosszul következik be, míg a serdülőkori zsírbetegség növeli a tartós elhízás és szövődményeinek kockázatát. Ebben a tanulmányban összehasonlítottuk a cIAP2 expressziós modellt felnőtteknél gyermekeknél. Az eredmények azt mutatták, hogy a cIAP2 mRNS expressziójának depó-specifikus különbsége következetes volt gyermekeknél és felnőtteknél. A CIAP2 mRNS expresszió nem mutatott szignifikáns korfüggő változásokat. A cIAP2 mRNS expressziója és a BMI vagy a nem között nem volt szignifikáns kapcsolat. Érdekes módon az OM és az SC közötti különbség kifejezettebb volt a gyermekeknél. Mivel a zsigeri zsírszövet gyermekkorban korlátozott, a gyermekeknél a magasabb expresszió általában csak a zsigeri zsírszövet nettó nyereségét tükrözi a növekedés során, és így alacsonyabb érzékenységet az apoptózisra. Ezt a lehetőséget támasztja alá az a megfigyelés, miszerint a NIAP expressziós szintje a szubkután hasi preadipocytákban a súlycsökkenés után 3-5-ször magasabb, ami elősegíti a súly helyreállítását. 20
Ebben a tanulmányban nem tudtunk kimutatni semmilyen különbséget az apoptózis alapsebességében a két depóból származó adipociták között. A valószínű magyarázat az, hogy a bazális apoptotikus indexek túl alacsonyak voltak a pontos kvantifikációhoz és összehasonlításhoz. Ezt a nézetet támasztja alá az a tény, hogy Prins et al. A 17. ábra azt mutatta, hogy a szérumtartalmú táptalajban tenyésztett zsírsejtek bazális apoptotikus indexe az alkalmazott módszertől függetlenül nagyon alacsony volt. Nem zárhatjuk ki azonban, hogy az alkalmazott módszer túl érzéketlen ahhoz, hogy két zsírszöveti hely közötti apoptózis indexekben különbséget mutassunk, ami korrelálhat a cIAP2 expressziójának különbségével. Ezenkívül meg kell vizsgálni a cIAP2 expressziójának helyi különbségének fiziológiai szerepét a zsírszövetben.
Összefoglalva, összehasonlítottuk a cIAP2 mRNS expresszióját SC és OM zsírszövetben 12 gyermeknél és 11 felnőttnél. Magasabb relatív expressziót találtak az OM-ben az SC zsírszövethez képest gyermekeknél és felnőtteknél. Ez arra utal, hogy a cIAP2 differenciális expressziója a depók között a két depóból származó sejtek belső tulajdonságainak tudható be. A gyermekeknél a gyermekkori lerakódásokban kifejezettebb különbség tükrözheti a zsigeri zsírszövet növekedésének növekedését.
köszönöm
Ezt a munkát a Jiangsu Oktatási Bizottság Tudományos Kutatási Alapja (320012) és a Svéd Orvosi Kutatási Tanács (19X-05708) támogatta. Köszönjük Dr. Xu Xiaoqun, Lou Yao, Chen Yijiang és Prof. Peter Naredi a zsírszövet mintájának biztosításáért ezekhez a tanulmányokhoz, Tommy Olsson professzor pedig a gyümölcsöző beszélgetésekért.