Az Lncrna sra elősegíti a máj steatosisát a zsír triglicerid lipáz (atgl) expressziójának elnyomásával -

• elemeket
• absztrakt
• bevezetés
• az eredmény
• Az SRA hiány növeli a máj ATGL expressziójának szabályozását
• Az ATGL és SRA szintet közvetetten szabályozzák az éhomi egerek állapotában
• Az SRA gátolja az ATGL promoter transzaktiválását a Fox01 által
• Az SRA gátló hatása az ATGL transzkripcióra független az inzulintól
• Az SRA gátolja az ATGL promoter transzaktivációját a PPARy-val
• vita
• mód
• Állatok és étrend
• RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR
• immunblotta
• Sejtkultúra és kezelés
• Plazmidok, transzfekció, retrovírus fertőzés és riporter gén vizsgálatok
• Géncsendesítés rövid hajtű RNS (shRNS) segítségével
• ATGL által közvetített FFA β-oxidációs vizsgálatok
• ATGL aktivitási vizsgálatok
• TAG teszt hepatocitákban
• Statisztikai analízis
• Hivatkozások
• köszönöm
• További információ
• PDF fájlok
• További információ
• Hozzászólások

elemeket

• Inzulinjelzés
• A betegség mechanizmusai
• Átírási szabályozási elemek

absztrakt

Az alkoholmentes zsírmájbetegség (NAFLD), a krónikus májbetegség leggyakoribb formája, a májzsír túlzott felhalmozódásával nyilvánul meg. Nemrégiben kimutattuk, hogy a hosszú, nem kódoló RNS (lncRNS) szteroid receptor RNS aktivátor (SRA) (SRAKO) genetikai kiiktatásával rendelkező egerek ellenállnak a magas zsír elhízás okozta elhízásnak egy olyan fenotípussal, amely magában foglalja a jobb glükóztoleranciát és az attenuált máj steatosist A mechanizmust ebben a tanulmányban vizsgáltuk. Megállapítottuk, hogy az SRA és a zsíros triglicerid lipáz (ATGL), a fő máj triacilglicerin (TAG) hidroláz májszintjét fordítva szabályozták egerek éhgyomrával, a máj ATGL expresszióját pedig SRAKO indukálta normál és magas zsírtartalmú étrenden (HFD). . ) etetés. Az SRA elvesztése az elsődleges hepatocitákban vagy a hepatocita sejtvonalban felemelkedik, de az SRA erőltetett expressziója gátolja az ATGL expressziót és a szabad zsírsav (FFA) β-oxidációját. Az SRA gátolja az ATGL promóter aktivitását, különösen azáltal, hogy gátolja a transzkripciós faktor, a villafehérje O1 (FoxO1) egyébként indukáló hatásait. Adataink az SRA új funkcióját tárják fel a máj steatosis elősegítésében az ATGL expresszió elnyomásával.

A közelmúltban hosszú, nem kódoló RNS-ek (lncRNS-ek) jelentek meg a különféle biológiai folyamatok fontos szabályozóiként, ideértve az őssejtek pluripotenciáját, az embriogenezist, a sejtek differenciálódását 12, 13 és a máj lipidanyagcseréjét 14. Az RNS-szteroid receptor aktivátort (SRA) kezdetben lncRNS-ként jellemezték, amely RNS-koaktivátorként működik a szteroid nukleáris receptor-függő génexpresszió növelése érdekében 15. Ezt követően az SRA kimutatták, hogy RNS-koaktivátorként működik a nem szteroid nukleáris receptorok 16-án, 17-ben, és fontos szerepet játszik a myogenesis 18-ban, 19-ben, 20-as szteroidogenezisben, emlő tumorgenenesisben 21, 22, 23 és kardiomiopátiában 24. A Sra1 gén egy alternatív transzkriptumot is létrehoz, amely az SRAP 25, 26 nevű fehérjét kódolja, bár az SRAP funkciója nagyrészt ismeretlen.

Nemrégiben kimutattuk, hogy az SRA számos mechanizmus révén elősegíti az adipociták differenciálódását és az inzulin által stimulált glükózfelvételt az adipocitákban számos mechanizmus révén, például a peroxiszóma proliferátor által aktivált receptor γ (PPARγ) transzkripciós aktivitásának koaktiválása, az adipocita 27 receptorral kapcsolatos gyulladásos génexpresszió gátlása, vagy előléptetése, 28. Az SRA funkció in vivo értékeléséhez globális egereket állítottunk elő knock-out Sra1 génekkel (SRAKO) 29. A csökkent zsírtartalom mellett az SRAKO egerek csökkentették a máj TAG szintjét és az étrend okozta elhízással szembeni ellenállást. Ezek az adatok először utalnak az SRA szerepére a máj lipidanyagcseréjében 29. Itt tisztázzuk a mechanizmust azzal, hogy megmutatjuk, hogy az SRA gátolja az O1 villafehérje (FoxO1) transzkripciós aktivitását a májsejtekben inzulinfüggetlen útvonalon keresztül, ezáltal csökkentve annak downstream génjének, az ATGL-nek a kulcsfontosságú lipolitikus enzimének az expresszióját, és ezt követően csökkentve a β -oxidáció, hepatociták FFA.

az eredmény

Az SRA hiány növeli a máj ATGL expressziójának szabályozását

Négyszeres WT-HFD egerekben a

2-szeres leptinhiányos egerekben (ob/ob) a WT-Chow egerekhez képest (3a. Ábra, bal oldali panel). Ezzel szemben a telítettség állapotában az SRA szintek viszonylag magasabbak voltak és változatlanok voltak HFD vagy leptin hiány esetén.

( a ) Az éheztetett vagy etetett WT-chow (n = 5) vagy WT-HFD (n = 6) és ob/ob (n = 8) egerek (20 hetes korban) SRA és ATGL mRNS szintjét meghatároztuk RT-qPCR használatával. Az MRNA szinteket normalizáltuk a 36B4 expresszióra. Az adatokat átlag ± SE-ként adjuk meg, és a WT-chow egerekhez viszonyított szeres változásként fejezzük ki. ( időszámításunk előtt ) A WT-chow, a WT-HFD és az ob/ob egerek máj- vagy májkivonatait immunblotolták anti-Fox01, anti-ATGL, anti-laminB1 és anti-β-aktin antitestekkel. ) Eheztetett egerek. c ) egerek a takarmányban. ( d ) A chow-val vagy HFD-vel táplált WT vagy SRAKO (KO) egerek májmag-kivonatait immunblotolták anti-Fox01 és anti-laminB1 antitestekkel. ( b - d ) A jobb oldali panelek láthatók, a sávok mennyiségi meghatározása az immunblotokban. * 33. o. Ezenkívül az SRA hiánya nem befolyásolta a FoxO1 magfehérje tartalmát a májban (3d. Ábra). Ezek az eredmények arra engednek következtetni, hogy az SRA olyan mechanizmussal szabályozza az ATGL expressziót, amely nem jár a nukleáris FoxO1 szint változásával.

Az SRA gátolja az ATGL promoter transzaktiválását a Fox01 által

Köztudott, hogy a Fox01 kötőhelyekkel rendelkezik az ATGL gén -3 kb promóter régiójában, és fokozza az ATGL transzkripció szabályozását a 33 adipocitákban. A Fox01 mind a máj glükóztermelését, mind a lipidanyagcserét szabályozza 34, 35. A Fox01 túlzott expressziója mind az mRNS, mind az ATGL fehérje szintjét szabályozza a hepa1-6 sejtekben (4a. Ábra), ami arra utal, hogy az ATGL transzkripciót a FoxO1 közvetlenül szabályozza a hepatocitákban. A további értékeléshez az ATGL riporter luciferáz promótert használtuk 3 kb promóterrel, és azt találtuk, hogy ez a vektor 75-szer nagyobb luciferáz aktivitást mutatott, mint a pGL3-kiindulási kontroll (4b. Ábra). SRA RNS-t kódoló plazmid együtttranszfekciója, de nem SRAP fehérjét gátolta az ATGL promoter által vezérelt luciferázt

25% (4c. Ábra). Annak igazolására, hogy az SRA rendelkezik-e gátló hatásával a Fox01 révén, a Fox01-et és az SRA-t kotranszfektáltuk a luciferáz rendszerrel (4d. Ábra). Ahogy az várható volt, a Fox01 önmagában ötszörösére növelte az ATGL promoter által hajtott luciferázt, de az SRA kotranszfekció elnyomta ezt a Fox01 által közvetített hatást (4d. Ábra). Az SRA képessége a Fox01 által közvetített luciferáz aktivitás gátlására dózisfüggő volt (4e. Ábra). Továbbá az AS1842856 Fox01 inhibitor (1 μM) a Fox01 aktivitás folyamatos szuppresszióját indukálta (S4a. Kiegészítő ábra), és csökkentette az SRA ATGL promoter aktivitásra gyakorolt ​​gátló hatását (4f. Ábra). Az SRA túlexpresszióval ellentétben az SRA leütése növelte az ATGL promoter aktivitását (4g. Ábra, h), amelyet az AS1842856 (4h. Ábra) megakadályozott. Összességében ezek az adatok arra engednek következtetni, hogy az SRA úgy szabályozza az ATGL expressziót, hogy gátolja a Fox01 ATGL transzkripciót elősegítő képességét.

Az ATGL a fő máj TAG hidroláz, amely szabályozza a máj FFA oxidációját 8, 9. Magasabb szubsztrát-specifitása van a TAG-ra, mint a hormonérzékeny lipázra (HSL), amelyet korábban a domináns TAG-hidroláznak tekintettek 46. Ebben a tanulmányban azt találtuk, hogy az SRAKO mind a HFD, mind a normál takarmánytáplálás során szabályozta az mRNS és a fehérje szintjét a máj ATGL-ben (1. ábra). Ezenkívül az ATGL expressziót SRAKO hepatocytákban indukálták (2a. Ábra), ami az ATGL enzimek aktivitásának megnövekedését eredményezte a májban (S2. Kiegészítő ábra) és a hepatocita ketonok testtermelésének aktiválódását (2b. Ábra), amely termék és indikátor FFA β-oxidáció. Hasonló eredményeket találtunk a Hepal-6 hepatocita sejtvonalban az endogén SRA leütésével is (2c. Ábra, d). Ezzel szemben az erőltetett SRA expresszió gátolta az ATGL expressziót és csökkentette az FFA β-oxidációját (2e. Ábra, f). Fontos, hogy bebizonyítjuk, hogy az SRA éhgyomri után indukálódik a máj elhízásában (3a. Ábra), és hogy az SRA és az ATGL májszintjei közvetett összefüggésben vannak a WT-Chow, a WT-HFD és az ob/ob egerekben (3a. Ábra). B) . Így az SRA szintje az energiaszinttől és az anyagcsere körülményektől függően változik, amelyek az ATGL inverz expressziójához vezetnek a májban.

A Fox01 transzkripciós faktor ATGL expressziót indukál a 33 adipocitákban és a hepatocytákban (4a. Ábra). Az in vivo genetikai kiütés és a túlexpresszió, a leütés és az inhibitor vizsgálatok tenyésztett sejtekben történő kombinációja arra utal, hogy az SRA a Fox01 transzkripciós aktivitásának megzavarásával gátolja az ATGL transzkripciót (1., 3. és 4. ábra).

Adipocitákban az inzulin indukálja a Fox01 felszabadulását a sejtmagból a citoplazmába, ezáltal gátolja az ATGL33 transzkripcióját. Korábbi vizsgálatok a 27., 28. adipocitákkal és a jelenlegi májsejtekkel végzett vizsgálat (5a. Ábra) azt mutatják, hogy az SRA stimulálja az Akt, Erk1/2 és célpontjuk FoxO1 inzulin által indukált foszforilációját, ami ellentmondani látszik korábbi adatainknak, miszerint az SRAKO gyengítette az inzulint. HFD által kiváltott ellenállás 29. Az SRAKO egerekben az inzulinérzékenység javulása azonban valószínűleg másodlagos a máj steatosisának és elhízásának gyengüléséhez képest. Az inzulin és az SRA gátolja az ATGL Fox01 által közvetített transzkripcióját, de a mechanizmusok azért különböznek egymástól, mert csak az inzulin indukálja a Fox01 nukleáris exportját (5b. Ábra), és az SRA represszív hatása inzulinfüggetlen. Lehetséges, hogy az SRA hatása az inzulinjelzés elősegítésére túl kicsi ahhoz, hogy a Fox01 mag lokalizációját modulálja, legalábbis ennek a tanulmánynak a feltételei mellett.

A 39., 47. adipociták ATGL-transzkripcióját szabályozó másik transzkripciós faktor, a PPARy, megerősítést nyert, hogy hasonló hatást mutat a hepatocitákban, amikor a PPARγ ligandum aktiválja (6a. Ábra). Az ATGL megnövekedett transzkripcióját a PPARγ-aktivált ligandum segítségével azonban SRA csökkentette az alapszintre (6b. Ábra), a Fox01-től független hatás (6c. Ábra). Az SRA-PPARγ-ATGL út potenciális jelentősége ellenére a Fox01 és a PPARγ inhibitorokat alkalmazó vizsgálatok arra utalnak, hogy PPARγ ligandum hiányában az SRA a Fox01, nem pedig a PPARγ által végzett ATGL transzkripcióra gyakorolja elnyomó hatását (4. és 6. ábra).

Az SRA mögött álló molekuláris mechanizmus, amely represszorként működik a Fox01-ben és a PPARγ-közvetített ATGL transzkripcióban, még nem teljesen tisztázott. Korábbi tanulmányok azt sugallják, hogy az SRA RNS-koaktivátorként működhet azáltal, hogy komplexet képez fehérje-koaktivátorokkal, például SRC-1 15-vel, és hogy ezekben a komplexekben 19, 20, 48 állványmolekulaként működhet. Az SRA azonban elnyomó funkcióval is rendelkezik, és kölcsönhatásba lép az NR SHARP 49 és SLIRP 50 corepresszorokkal, és a HP1, LSD1, HDAC1/2 és CoREST tartalmú represszív komplexek állványaként működik, hogy a progeszteron receptor által szabályozott géneket elhallgattassa 51 hormon hiányában. Ezenkívül az SRA komplexeket képezhet tritorax csoportokkal és polikombor represszor komplex 2 komplexekkel az 52 hiszton aktiváló vagy represszív módosításainak végrehajtására. Ezért az SRA kontextustól függően képes mind koaktivációs, mind elnyomó funkciókat végrehajtani. Feltételezzük, hogy a májban az SRA állványként működik, és egy represszív komplexet toboroz a Fox01 és a PPARγ által közvetített AT01 transzkripció visszaszorítására.

Összefoglalva, a jelen tanulmány azt mutatja, hogy az SRA és az ATGL máj expressziója fordítottan korrelál, és az SRA vesztesége az egér májában vagy hepatocitáiban elsősorban azáltal fokozza az ATGL expresszióját, hogy elősegíti a FoxO1 induktív hatását, ami megnövekedett FFA-hoz vezethet. β-oxidáció és védelmet nyújt a máj steatosis ellen étrend okozta elhízás esetén.

mód

Állatok és étrend

SRAKO egereket a korábban leírt módon állítottunk elő 29. A leptinhiányos egereket (ob/ob) a kínai Nanjing Egyetem Állat-kutatási Központjától vásároltuk. Az egereket kórokozóktól mentes gáton helyeztük el, 12 órás világos/sötét ciklusban, és szabad hozzáférést kaptak az élelemhez és a vízhez. 8 hetes korban az SRAKO egereket (KO) és a vad típusú alomtársakat (WT) normál laboratóriumi rágcsáló-chow-diétával (Chow) (Xietong Organism, Nanjing, Kína) vagy magas zsírtartalmú étrendet (HFD, 60% zsírtartalmú) táplálták., 20% szénhidrát, 20% fehérje; Research Diets, New Brunswick, USA) 12 hétig. ob/ob egerek 20 hetes koráig chow-étrendet tápláltak. Az egereket a könnyű fázisban feláldoztuk 16 órás táplálék nélkül, vagy koplalás nélkül. A szöveteket azonnal izoláltuk, lemértük és folyékony nitrogénben tároltuk. Minden állattenyésztés és állatkísérlet megfelelt a Nanjing Orvostudományi Egyetem állatkísérleti szabályzatának irányelveinek, és a Nanjingi Orvostudományi Egyetem állatkísérleti bizottsága jóváhagyta.

RNS extrakció és kvantitatív valós idejű PCR

A teljes RNS-t a májból vagy sejtekből RNAiso Plus (Takara Bio Inc., Dalian, Kína) alkalmazásával extraháltuk, és az M-MMLV reverz transzkriptáz és RNasin ribonukleáz inhibitorok (Promega Biotech Co., Ltd, Peking, Kína) alkalmazásával reverz transzkripcióval írtuk le. a gyártó protokolljai. A qPCR-t SYBR Premix Master Mix (Thermo Scientific Inc., Shanghai, Kína) alkalmazásával hajtottuk végre. Primer szekvenciák a Pparα, Mcad, Lcad, Cpt1α, Cpt2, Cd36, Fatp1, L-fabp, Acsl1, Acox1, Acaa1b, Acaa2, Atgl, Hsl, Acly, Fasn, Acc1, Acc2, Scd1, Mtgpat1, Dgat1, Dgat2, Mttp, Apoc2, Apoc3, Vldlr és Sra összefoglalását az S1 kiegészítő táblázat tartalmazza. Az mRNS expressziós szintjét normalizáltuk a riboszomális fehérje, a nagy, P0 (36B4) mRNS szintjére.

immunblotta

A májlizátumokból, a sejtlizátumokból, a sejtmagból és a sejtek citoplazmájából származó fehérjéket korábbi 53 módszerekkel vagy kitekkel extraháltuk (Beyotime Biotechnology, Shanghai, Kína). Primer antitesteket használtunk 1: 1000 hígításban. Anti-foszfo-FoxO1 (# 9461), FoxO1 (# 2880), foszfo-ERK1/2 (# 4370), ERK1/2 (# 4695), foszfo-Akt (Thr308) (# 9275), foszfo-Akt (Ser473) ) (# 9271), Akt (# 4685), ATGL (# 2439), PPARγ (# 2435), B1 laminát (# 13435), β-aktint (# 3700) és torma-peroxidázzal konjugált anti-egér vagy nyúl IgG-t kaptunk. a Cell Signaling Technology cégtől vásárolta. Anti-SRAP antitestet (# A300-743A) a Bethyl Laboratory, Inc.-től vásároltunk.

Sejtkultúra és kezelés

HepG2 humán hepatocarcinoma sejteket és Hepa1-6 egér hepatocarcinoma sejteket tenyésztettünk Dulbecco módosított Eagle táptalajában (DMEM; Invitrogen), 100 mg/ml streptomicin-szulfáttal (Sigma - Aldrich), 100 U/ml penicillin G-vel (Sigma - Aldrich) és 10% (v/v) szarvasmarha-magzati szérum (FBS; Invitrogen), és 37 ° C-on 5% CO 2 és 95% levegő atmoszférában tartjuk. Az elsődleges májsejteket vad típusú vagy SRAKO egerekből izolálták, és William E-táptalajában (Sigma - Aldrich) növesztették FBS-sel és antibiotikumokkal, a korábban leírtak szerint 54. A sejteket 5 órán át szérumban éheztettük, majd 5 percig inzulinnal (10 nM) vagy anélkül kezeltük. Az inzulinkezelés előtt a sejteket 30 percig előkezeltük MG132-vel (Sigma - Aldrich, 50 μM), wortmanninnal (Sigma - Aldrich, 1 μM) vagy trametinibel (MedChem Express, 1 μM).

Plazmidok, transzfekció, retrovírus fertőzés és riporter gén vizsgálatok

Géncsendesítés rövid hajtű RNS (shRNS) segítségével

A korábbi 27. módszer szerint a Hepa1-6 sejtekben az endogén egér SRA-t egy 293T sejtekben létrehozott SRA ellen irányított, shRNS-t expresszáló shRNS-t expresszáló lentivírus fertőzése okozta, amelyet egy éjszakai kötődés után 8 mg/ml polibrénnel (Sigma) egészítettünk ki. A fertőzést 8-12 órás időközönként megismételtük. A sejteket 72 órával a második fertőzés után kísérleteknek vetettük alá.

ATGL által közvetített FFA β-oxidációs vizsgálatok

A hepatocitákat vagy Hepa1-6 sejteket teljes táptalajban tenyésztettük olajsavval (100 μM) 16 órán át. Ezután a sejteket szérummentes, fenolpiros és glükózmentes DMEM-ben (Sigma) inkubáltuk 4 órán át (R) -bróm-benzol-laktonnal vagy anélkül (25 μM, Cayman Chemical Company, Ann Arbor, USA). A ketontesteket, a táptalajba felszabaduló FFA β-oxidáció termékeit D-3-hidroxi-butirát-vizsgálati készlettel (Megazyme Internatioanl Ireland, Bray, Írország) vizsgáltuk. Az ATGL-közvetített FFA β-oxidációt a D-3-hidroxi-butirát-termelés különbségeként számoltuk ki az ATGL-specifikus inhibitorral (R) -bromoenol-laktonnal kezelt vagy anélkül kezelt sejtek között, a sejtfehérje szintre normalizálva, azaz a D-3 -hidroxi-butirát előállítása (R) -bróm-benzol-laktonnal.

ATGL aktivitási vizsgálatok

A májlizátumok TAG hidroláz aktivitását TAG hidroláz vizsgálati készlettel (Jiancheng Bioengineering Institute, Nanjing, Kína) vizsgáltuk, és a máj lizátum fehérje szintjére normalizáltuk. Az ATGL aktivitást a TAG hidrolázaktivitás különbségeként számoltuk (R) -bromoenol-lakton (25 μM) jelenlétében és hiányában, azaz a TAG-hidroláz aktivitásnak az (R) -bromoenol-laktonnal szuppresszálható részét.

TAG teszt hepatocitákban

A májsejteket 0,1 M sósavoldatban homogenizáltuk és kloroform/metanol 2: 1 arányú elegyével extraháltuk. A szerves fázist szárazra pároljuk. A lipidmaradékokat izopropanolban oldottuk, és a TAG assay kit (GPO-PAP; Dongou Bioengineering Co. Ltd., Wenzhou, Kína) alkalmazásával mértük. A TAG szintet a hepatociták fehérje szintjére normalizálták.

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlag ± SE-ként fejezzük ki. A csoportok közötti adatokat Student t-próbájával vagy egyirányú ANOVA-val elemeztük, majd Bonferroni - Dunn többszörös összehasonlítással. A különbségeket P szempontjából szignifikánsnak tekintették