tnfaip3

  • elemeket
  • absztrakt
  • A fő
  • az eredmény
  • Epidermis-specifikus A20-hiányos egerek generálása
  • Az A20 EKO egerek keratinocita hiperpláziát mutatnak
  • Az A20 EKO egerek rendellenességeket mutatnak az ektodermális kiegészítőkben
  • Az A20 az EDA útjának szabályozójaként aktiválja az NF-κB aktiválását
  • vita
  • További információ
  • Képfájlok
  • További 1. ábra
  • Word dokumentumok
  • További kép 1 Jelmagyarázat
  • szójegyzék

elemeket

absztrakt

A fő

Az epidermisz főként különböző rétegekben elrendezett keratinocitákból áll. A bazális keratinociták mitotikusan aktívak, és új sejteket hoznak létre, amelyek fokozatosan differenciálódnak a bőrfelszín felé, ahol kukoricáznak és lehasadnak. Ezt a jól szervezett biológiai folyamatot szigorúan ellenőrzik, és az események sorrendjének megszakítása különféle bőrbetegségekhez vezethet, beleértve a gyulladást és a rákot is. A nukleáris faktor KB (NF-kB) transzkripciós faktor pontos ellenőrzése elengedhetetlen a bőr homeosztázisának fenntartásához, amit az a tény is bizonyít, hogy a túlzott NF-kB B aktivitás, valamint az esszenciális NF-kB B aktivátorok ablációja bőrgyulladáshoz vezet, Az 1, 2, 3 NF-kB a strukturálisan rokon és evolúcióval konzervált fehérjék (p100 vagy NF-kB B2, p105 vagy NF-kB B1, p65 vagy RelA, RelB, c-Rel) családjába tartozik, amelyek homo- vagy heterodimerek. Nyugalmi sejtekben az NF-κB inaktív marad az inhibitor KB (IBB) fehérjékhez való kötődés révén, amelyek közül az IκBa-t tanulmányozzák a legjobban. Számos inger vezet az IκB fehérjék foszforilációjához és poliubikvitinálásához, amelyek a proteazomális lebontást célozzák meg. Ez NF-κB felszabaduláshoz vezet, amely felhalmozódik a sejtmagban és transzkripciós úton aktiválja a célgéneket.

Az NF-κB jelátvitel központi eseménye az IκB kináz (IKK) komplex aktiválása, amely két kinázból áll, az IKK1 és IKK2 (más néven IKK α és IKK β), valamint egy szabályozó platform fehérjéből, az NF-κ B esszenciális modulátor (NEMO, más néven IKK γ). Gén-irányított kísérletek kimutatták, hogy az IKF2 és a NEMO, de nem az IKK1 szükséges az NF-kB B tumor nekrózis faktor (TNF) és Toll-szerű receptorok általi aktiválásához. 3 Egyes receptorok, például a β-limfotoxin és a CD40 receptorok, aktiválhatnak egy alternatív NF-κB utat, amely magában foglalja az IKK1-et, és amelynek eredményeként a p100 NF-κB p52-vé alakul, amely transzkripciósan aktív dimert képez a RelB-vel.

Mivel az NF-κB kulcsfontosságú a fejlődésben és a gyulladásban, aktivációjának szigorú szabályozása szükséges. Ezt a szigorú ellenőrzést a pozitív és negatív szabályozók együttes fellépésével érik el. Az elmúlt években számos NF-κB jelátviteli komponens ubiquitination és de-ubiquitination (DUB) elemeit azonosították az NF-κB jelátviteli utak szabályozásának alapvető lépéseiként. Az NF-κB aktiváció egyik kritikus féke az A20 ubiquitin enzim, amelyet az NF-κB B aktiváció és apoptózis inhibitoraként jellemeztek. Az A20 szükséges az NF-KB jelátvitel megszakításához a TNF és mikrobiális termékek, például lipopoliszacharid és muramil-dipeptid hatására. Az A20 in vivo gyulladáscsökkentő aktivitásának fontosságát több szerv súlyos gyulladása és az A20 -/- egereknél megfigyelt perinatális halál szemlélteti. 24 A legújabb genetikai vizsgálatok összefüggést mutatnak az emberi A20/α (TNFAIP3) által kiváltott protein 3 gén gén és az autoimmun patológia és a pikkelysömör között, ami arra utal, hogy az A20 fontos szerepet játszhat az emberi autoimmun és gyulladásos megbetegedésekben. Ezek az eredmények rávilágítanak az A20 fontosságára a normál szöveti homeosztázis szabályozásában, és potenciális célpontként azonosítják számos gyulladásos patológia, köztük a pikkelysömör kezelésében.

K14-vezérelt Cre/LoxP-közvetített gén-célzást alkalmaztunk egerekben, hogy megvizsgáljuk az A20 in vivo funkcióját az epidermális fejlődésben és a homeosztázisban. Megmutattuk, hogy az A20 elengedhetetlen a keratinocita proliferáció szabályozásához és az ektodermális tagek megfelelő fejlődéséhez. Adataink arra utalnak, hogy az A20 keratinocita-specifikus deléciója EDA-A1 által kiváltott NF-κB túlzott expresszióhoz vezet, ami fenoszkópos transzgénikus EDA-A1 egérhez vezet.

az eredmény

Epidermis-specifikus A20-hiányos egerek generálása

A szövetspecifikus A20 funkciók azonosításához olyan egereket hoztunk létre, amelyek hordozzák azt a feltételes A20 allélt, amelyben az egér A20 génjének IV és V exonjait LoxP helyek határolják. 26 Az A20 működésének tanulmányozására dermális és epidermális kiegészítőkben kereszteztük az A20 FL/FL egereket egy transzgénikus egérvonallal, amely Cre-t expresszál a humán keratin 14 gén promoter (K14-Cre) irányítása alatt. 27 Epidermális keratinocita-specifikus A20-knockout egerek (A20 EKO) normál mendeli szegregációval születtek (az adatokat nem mutatjuk be). Az A20 keratinocita-specifikus deléciójának igazolására A20 EKO egerekben (1a. Ábra) Southern-blot analízissel megerősítettük, hogy a Cre-mediált rekombináció hatékony volt az epidermiszben és az elsődleges keratinocitákban (1b. Ábra). Ennek eredményeként nem tudtuk kimutatni az endogén A20-t az A20 EKO egerek epidermális kivonataiban (1c. Ábra).

A20 ECO egerek generálása. a ) A20 EKO egér és A20 FL/FL kontrollegér fényképe. ( ) A20 EKO egerekből származó epidermiszből és dermisből, valamint izolált keratinocitákból származó A20 FL/FL (WT) és A20 EKO egerekből származó DNS Southern blot elemzése. ( c ) A keratinocita-specifikus kiütésekből (A20 EKO) származó epidermális szövetfehérje-kivonatokat Western-blottolással elemeztük A20-specifikus antitesttel. Az A20 fehérje sávot nyíl jelöli, a csillag (*) a nem specifikus sávokat jelöli

Teljes méretű kép

Az A20 EKO egerek keratinocita hiperpláziát mutatnak

A bőrgyulladás makroszkopikus jeleit, például bőrpírt, hámlást vagy viszketés miatti túlzott karcolást nem figyeltek meg az A20 EKO egerekben (1a. Ábra). A háti bőrszakaszok szövettani elemzése az epidermisz fokozódását mutatta a bazális sejtek fokozott (2,5-szeres) proliferációja miatt (2. ábra), de hasonló nagyon alacsony apoptózisszintek voltak (az adatokat nem mutatjuk be). A kaszpáz-14, filaggrin és keratin 10 differenciálódási markerek expressziós mintázata normális volt, és a beszivárgó immunsejteket nem figyeltük meg (az adatokat nem mutatjuk be). Ezek az adatok arra utalnak, hogy az A20 hiánya nem vezet spontán bőrgyulladáshoz, vagy más DUB enzimek, például a cilindromatosis (CYLD) 28 túlzottan járnak el a spontán gyulladás megelőzésében.

Az A20 EKO enyhe keratinocita hiperproliferációt mutat. ( a ) Az A20 FL/FL és A20 EKO egerek hátsó bőrének részeit hematoxilinnal és eozinnal festettük, és fénymikroszkóppal elemeztük (skála: 100 μm). ( ) Az A20 FL/FL és A20 EKO egerek háti bőrszakaszainak Ki-67-pozitív festése (sötétbarna magok) (skála oszlop: 100 μm). ( c ) Az alapréteg ki-67-pozitív keratinocitáinak százalékos arányának meghatározása az A20 FL/FL és A20 EKO egerek háti bőrének részein.

Teljes méretű kép

Az A20 EKO egerek rendellenességeket mutatnak az ektodermális kiegészítőkben

Az A20 EKO egerek borítékát rendezetlen állapotban rendeztük el (1a. És 3a. Ábra). Ezt a kócos hajfenotípust soha nem figyelték meg az A20 FL/FL kontrolllyukakban. Az egereket 12 hónapos korukig figyeltük, és nem mutattak semmilyen hajhullást vagy alopeciát. Az A20 FL/FL egerek átjutottak a K5-Cre transzgénikus vonalra is, 29 amelyeknél hasonló fenotípust figyeltek meg (az adatokat nem mutatjuk be). Az összes többi kísérletet A20 FL/FL/K14-Cre egereken végeztük. 27.

Az A20 EKO egereknek vékonyabb a szőrük és sérült a kutikula. a ) AKO FL/FL és A20 EKO egerek bundájának képe. ( ) Az A20 FL/FL és A20 EKO egerek hátsó részének szőrét epiláltuk. A mikroszkópos vizsgálat az őrszőr, a szőrszőr, a görbe haj és az auchen szőr jelenlétét mutatja az A20 FL/FL kontroll egerekben. Az A20 EKO egereknek csak egyenes vagy göndör hajuk van. ah, gyenge haj; au, auchen haj; gh, őrszőr; zz, görbe szőr. ( c a d ) Az A20 FL/FL és A20 EKO egerek szőrzetének SEM képe (skála oszlop: 10 μm). ( e a f ) TEM metszetek az A20 FL/FL és A20 EKO egerek hátsó bőrén keresztül, bemutatva a szőrtüsző szakaszának részleteit (skála: 500 nm). Az A20 EKO egereknek hiperplazis és rendezetlen bőrrétegük van. h, hajszál; c, kutikuláris réteg

Teljes méretű kép

Az E20 transzgének fenotípusát képező A20 EKO fenotípus egyéb jellemzői. a ) A binokuláris mikroszkóp alatt megfigyelt mancsok képe azt mutatja, hogy az A20 EKO egerek hosszabb körmökkel rendelkeznek, mint a kontrollalmok. ( ) A makroszkopikus farokelemzés hullámosabb farokszőrzetet és nagyobb redőket mutat, hasonlóan az A20 EKO egerekhez. ( c ) Az A20 EKO és a kontroll egerek bőrszakaszainak sebocitáit anti-adipophilin antitesttel festettük. (Méret: 500 μm.) ( D ) A faggyúmirigyen átmetszett szakaszok felületét e festés alapján határoztuk meg Volocity képelemző szoftver segítségével, és összehasonlítottuk az A20 EKO és a kontroll egerek átlagos felületét.

Teljes méretű kép

Az A20 az EDA útjának szabályozójaként aktiválja az NF-κB aktiválását

Mivel az A20 elvesztése a bőrben az EDA-A1 túlexpresszáló egerek részleges fenoszkópiájához vezet az epidermiszben, feltételeztük, hogy az A20 az EDA útvonalának negatív szabályozója lehet. Valójában egy NF-κB-függő riporter luciferázt (Luc) használva kimutattuk, hogy az A20 blokkolja az EDAR által indukált NF-κB aktivációt a HEK293T sejtekben, hasonló mértékben, mint a TNF által kiváltott NF-κB aktivációt (ábra). (5a) Deléciós mutánsok segítségével be tudtuk mutatni, hogy az EDAR által kiváltott NF-KB aktivációt a Z20 A20-tartalmú C-terminális doménje gátolta, de nem az N-terminális DUB domén (5b. Ábra és kiegészítő ábra). 1. ábra), jelezve, hogy a NUB-aktivitás nem szükséges az NF-KB aktiváció gátlásához. Ennek ellenőrzésére teszteltünk egy kétpontos mutánst (A20 D100A/C103A) is, amelyből hiányzik a DUB 32 aktivitás (5c. Ábra és 1. kiegészítő ábra). Az A20 D100A/C103A ugyanolyan hatásos volt, mint a vad típusú A20, az NF-KB által indukált EDF gátlásában, megerősítve, hogy az A20 DUB aktivitás nem szükséges ehhez a hatáshoz.

Az EDA-A1 stimulálása A20 expressziót indukál a hajplakk kialakulása során. a ) Az A20 expressziót in situ hibridizációval jelenítettük meg EDA-hiányos embriókon és WT E14-en, sötét kékes színnel, amely pozitív in situ jelet jelzett. A jobb oldali panel rezgő kivágást mutat, amelyen egy hajplakett található (nyíl). ( ) Az összes in situ hibridizációt E12 embriókon végeztük anti-sense szondával az A20 (bal oldali panelek) vagy a Wnt10b (jobb oldali panelek) számára, mint pozitív kontroll a fog plakkban (felső panelek) és a mellrügyben (alsó panelek) történő expresszió szempontjából. . F, mellső lábak; H, hátsó végtag; Én, vágó placode; m, mellrügyek; M, moláris kód; T, nyelv

Teljes méretű kép

vita

Az IkBα-hoz hasonlóan az A20 is fontos negatív szabályozója az NF-κB jelátvitelnek és gyulladásnak. 25 Hatásmódjuk azonban teljesen más. Az IkBa úgy működik, hogy közvetlenül az NF-κB-hez kötődik és elválik a magtól, míg az A20 egy ubiquitin-szerkesztő enzim, amely több célt inaktivál az NF-κB útvonalban. Az IKBa mindig jelen van a stimulálatlan sejtekben, hogy korlátozza az NF-kB B szabályozatlan aktiválódását specifikus gyulladásos kiváltó tényező hiányában. Ezzel szemben a legtöbb stimulálatlan sejtben az A20 expresszió gyenge, de erősen indukálódik az NF-KB jelátvitel aktiválásakor. Mivel az IkBa expresszió tovább indukálódik az NF-κB kiváltásakor, mind az IkBa, mind az A20 részt vesz az NF-κB aktiválás negatív visszacsatolási hurokjában. Az IkBα vagy a teljes A20 null egerekben fellépő hipergyulladás és idő előtti haláluk jelzi az IkBa és A20 kritikus funkcióit az NF-κB szabályozásában. 24, 35, 36, 37

A túlzott NF-κB jelátvitel a bőrben, például az IBB α-knockout egerekre és a K5-IKK2 transzgénikus egerekre specifikus keratinocitákban, dermatitist indukál. 37, 38 Váratlanul, bár az A20 EKO egereknél epidermális hiperproliferáció alakult ki, spontán gyulladásuk nem alakult ki. A funkcionális IKBa jelenléte elegendő lehet a környezeti sértésekkel szembeni kisebb gyulladásos válaszok szabályozásához. Alternatív megoldásként az NF-kB aktiválását szabályozó redundáns DUB enzimek, például a CYLD, aktívak lehetnek a bőrben. Noha a CYLD az epidermiszben meg van jelölve, a CYLD -/- egerek nem mutatnak bőrelváltozásokat. 28 A20 és CYLD ablációra lehet szükség spontán súlyos dermatitis esetén.

Megmutattuk, hogy az A20 epidermiszpecifikus deléciója több rendellenességhez vezet az ektodermális szervekben, hasonlóan az EDA út túlaktiválásához. 18., 19., 20., 21., 22., 39. Az A20 EKO egerek hasonlósága az EDA-A1 vagy EDAR túlexpresszáló egerekkel és az ED20 jelátvitel in vitro A20 gátlása határozottan arra utal, hogy az E20 útjának hiperaktiválása az A20 elsődleges oka. ECO fenotípus. Ezt a következtetést támasztja alá az a megállapításunk is, hogy az EDA-A1 indukálja az A20 expressziót, és hogy az A20 mRNS együtt lokalizálódik az Edar és az NF-KB jelátviteli aktivitással a szőrtüsző fejlődésében. Az A20 köztudottan gátolja a különféle jelátviteli utak által kiváltott NF-KB jelátvitelt, és kimutatták, hogy függ OTU doménjének DUB aktivitásától és a C-terminális Zn-ujjak ubiquitin ligálásától. Kimutathattuk, hogy a DUB A20 aktivitás nem vesz részt az EDAR szignalizáció gátlásában.

Az A20 EKO egerek és az EDA-A1-transzgenikus egerek közötti hasonlóság köröm- és hajhibákat, valamint faggyúmirigy-hiperpláziát tartalmaz. További fogak és mellbimbók is kifejlődtek az EDA-A1 transzgéneknél, de ezeket a rendellenességeket soha nem figyelték meg az AKO EKO egereknél. Lehetséges, hogy ezeken a helyeken az A20 nem szabályozza az EDA-A1 jelátvitelt, ami korrelál a detektálható A20 expresszió hiányával a fogak és a mellrügyek lepedékkódjaiban. Az is lehetséges, hogy a túlzott fog- és mellrügyek kialakulása erősebb EDAR-aktivitást igényel, ami túlzott ligandumtermeléssel érhető el, de nem a jelátvitelt gyengítő negatív visszacsatolási mechanizmus eltávolításával. Egy másik magyarázat az, hogy a K14-Cre által közvetített A20 deléció túl későn történhetett meg, hogy lehetővé tegye az ektopikus szerv primordiáinak indukcióját, mivel a K14-Cre expresszió E15-nél a legerősebb, míg a fogászati ​​és tejkódok E11-től E12-ig kezdődnek. 41

Összegzésként megállapítottuk, hogy az A20 egy EDA-A1 által indukált fehérje, amely az EDAR-függő NF-KB jelátvitel inhibitoraként működik, függetlenül annak DUB-aktivitásától. Következésképpen az A20 genetikai deléciója a keratinocitákban befolyásolja az epidermális tag normális fejlődését, hasonlóan az EDA-A1 vagy EDAR túlexpresszáló transzgénikus egereknél megfigyelthez.