absztrakt
A DNS-metilezés érdekes eredménye az egész kromoszómák, transzgének, bizonyos, a fejlődés szempontjából szabályozott gének és az emberi betegség génjeinek transzkripciós elnémítása (Knight et al., 1993; Li et al., 1993; Norris et al., 1994). A metilezés a CpG szigetén a kromatin szerkezetének változásához vezet (Klein és Costa, 1997), és egyes esetekben közvetlenül megakadályozza a pozitív tényezők kötődését a szabályozó elemekhez (Kass et al., 1997). Egy nemrégiben végzett tanulmány azonban kimutatta, hogy a metilezés önmagában nem képes elnémítani egy gént (Nan et al., 1997). Néhány metilált DNS-kötő fehérjére (MeCP) van szükség ebben a folyamatban. Mivel számos teljesen metilezett gén metil-CpG-kötő fehérjék hiányában szinte normál sebességgel írható át, nem valószínű, hogy a CpG-metilezés önmagában ezeket a helyeket elérhetetlenné teszi az alap transzkripciós készülék számára, vagy megakadályozza a transzkripciós faktorok és a promoterek kölcsönhatását.
Laboratóriumunk részt vesz az MT-I transzkripciót moduláló kulcs promoter elemek és transzaktivációs faktorok azonosításában (Datta és Jacob, 1993, 1997; Aniskovitch és Jacob, 1997, 1998). E vizsgálat során azt figyeltük meg, hogy ez a gén nem indukálódik az egér lymphosarcoma sejtekben (P1798), ellentétben az anyai thymus sejtek normális indukciójával. Ezt a vizsgálatot a promóter-metiláció potenciális szerepének meghatározására végezték el az MT-I gén expressziójának visszaszorításában limfoszarkóma sejtekben.
az eredmény
A limfoszarkóma sejtek MT-I vagy MT-II géneket expresszálnak nehézfémekre válaszul csak 5-azacytidinnel történő kezelés után.
MT-1 mRNS Northern blot elemzése lymphosarcoma sejtekben az 5-azacytidinnel és nehézfémekkel végzett kezelés előtt és után. A kontroll sejtekből izolált (30 μg) RNS-t és az 5-AzaC-val (2,5 μM) 72 órán át kezelt sejteket formaldehid-agaróz gél elektroforézissel (1,2%) elválasztottuk, nejlonmembránra vittük és UV-fénnyel térhálósítottuk. A membránt ezután Northern blot analízisnek vetettük alá, először véletlenszerűen aktivált, (32 P-jelölt) egér MT-I cDNS-sel, majd patkány GAPDH cDNS-sel. Az 1–3 sáv az RNS szintjét jelzi a kezeletlen kontroll sejtekben, a 3 órás ZnSO 4-gyel (50 μM) és a CdSO 4-gyel (15 μM) kezelt sejtekben. A 4–6. Sáv az RNS szintjét jelzi a kezeletlen sejtekben, 3 órán át ZnSO 4-gyel (100 μM) és CdSO 4-vel (30 μM) kezelt sejtekben az 5-AzaC kezelés után.
Teljes méretű kép
Genomikus nyomelemzés azt mutatja, hogy a lymphosarcoma sejtekben lévő transzkripciós aktivátorok egyike sem képes kötődni az MT-I promoterhez in vivo
Az MT-I promoter in vivo nyomelemzése 5 'alsó szálú primerekkel az 5-AzaC kezelés előtt és után. A limfoszarkóma sejteket az 5-AzaC kezelés előtt és után 0,1% dimetil-szulfáttal inkubáltuk, az Anyagok és módszerek szerint. A genomi DNS-t megtisztítottuk és piperidinnel tisztítottuk. LM-PCR alkalmazásával az MT-I proximális promóter alsó szálát amplifikáltuk és elválasztottuk 6% -os szekvenciájú gélen. A G-létrát autoradiográfiával detektáltuk. N-meztelen G-létra, C-kontroll és Cd2 + -15 μM CdSO4 kezelés. Az MRE-b, MRE-c, MRE-d, MRE-e és az MLTF/ARE szabályozási elemek a G-létra mellett vannak felsorolva. A nyilak (←) a CdSO4 által védett C-csoportokat, a csillagok (*) pedig a túlérzékeny G-csoportokat jelölik. Az 1–3 sáv a G-létra a meztelen DNS, a kontroll és a CdSO4-gyel kezelt P1798 sejtekben, míg a 4–6 sáv az 5-AzaC-val kezelt sejtek sávjait jelzi 72 órán keresztül. Az alsó nyíl megfelelő elhelyezése az MRE-c kötési helyén nehéz a gél mosolya, különösen a 6. sáv miatt.
Teljes méretű kép
A transzkripciós faktorok, amelyek mind a bazális, mind az indukálható MT-1 génexpressziót szabályozzák, aktívak a lymphosarcoma sejtekben.
MTF-1, Spl és MLTF/ARE elektroforetikus mozgáseltolódási tesztje S-100 limfocita sejt kivonatban. a ) A kontroll sejtekből és a ZnSO4-tal kezelt sejtekből (50 μM 3 órán át) származó S-100 kivonatokat (10 μg fehérje) optimális kötési körülmények között 32 P-jelzett MRE-d oligóval és DNS-fehérjével inkubáltuk. A komplexeket egy poliakrilamid (4% akrilamid, akrilamid: biszakrilamid = 38, 7: 1, 3) gélen választottuk szét 0,25 x TBE-vel, mint futó puffer. Az 1. és 5. sáv a kontrollsejtekből és a cinkkel kezelt sejtekből származó kivonattal képződött komplexeket jelenti. A 2–4. Sáv egy kontroll-kivonatot jelöl, amelyet 100-szoros moláris felesleggel inkubáltunk a jelöletlen MRE-ek, MRE-d és Sp1 oligóval. ( Az MLTF/USF DNS-kötő aktivitását 32 P-jelölt MLTF/ARE oligo alkalmazásával mértük a ( a ) és a komplexeket 6% -os akrilamid-gélen futtattuk, pufferként Tris (40 mM) -glicint (267 mM). Az 1. és 3. sáv a kontrollsejtek és a cinknek kitett sejtek kivonataival képződött komplexeket, a 3. sáv pedig az E-box konszenzusos oligó 100-szoros moláris feleslegével inkubált kontrollkivonatot jelöli.
Teljes méretű kép
Az MT-I promóter nem metilálódik a szülői sejtekben (egér csecsemőmirigy), de az összes CpG szekvencián metilálódik az egér lymphosarcoma sejtekben.
A PCR-amplifikált egér MT-I promóterének restrikciós enzimhely-feltérképezése egy szál-specifikus primerrel a kromoszóma DNS biszulfit konverziója után. Kromoszomális DNS-t izoláltunk kontroll sejtekből és 2,5 μM M-AzaC-kezelt (72 óra) P1798 sejtekből, valamint egér csecsemőmirigyből. Ezeket a mintákat ezután biszulfittal kezeltük, és az MT-I promoter felső láncát szál-specifikus primerekkel amplifikáltuk beágyazott PCR-rel, az Anyagok és módszerek szerint. Az amplifikált terméket (1 μg) ezután különféle restrikciós enzimekkel emésztettük, 2% -os alacsony olvadáspontú agarózgélen elválasztottuk és etidium-bromiddal festettük. ( a A 2–4. Sáv az Msp I, az Apo I és a Tsp509 I hasított lymphosarcoma kontroll DNS-t mutatja. Hasonlóképpen, a 6-8. Sáv az 5-AzaC-vel kezelt sejtekből származó amplifikált DNS-t, a 10-12. Sáv pedig a thymus DNS-t jelöli ugyanazokkal a restrikciós enzimekkel emésztve, mint a kontroll. Az 1., 5. és 9. sáv a kontroll, az 5-AzaC-vel kezelt limfoszarkóma és a csecsemőmirigy PCR-termékét jelenti, az M sáv pedig a 100 bázispár DNS-létrát jelöli (New England Biolab). ( ) Az 1–4. Sáv a kontroll sejtek és az 5-AzaC-vel kezelt limfocita sejtek amplifikált DNS-ével emésztett termékeket jelöli.
Teljes méretű kép
( a ) Metilezett CpG dinukleotidok az egér MT-I promóterében, amelyet limfoszarkóma sejtekben biszulfit genomi szekvenciával azonosítottak. ( ) Biszulfit átalakított és amplifikált MT-I promoter felső láncú DNS PCR-szekvenálása limfoszarkóma sejtekből az 5-AzaC kezelés előtt és után, valamint az egér csecsemőmirigyjéből. Az MT-I gén PCR-rel amplifikált felső szálát PCR szekvenálásnak vetettük alá femtomoláris DNS szekvenáló készlet (Promega) alkalmazásával, ugyanazokkal a primerekkel, amelyeket a beágyazott PCR második fordulójában használtunk, (a) thymus, (b) kontrollok és (c) 5 -AzaC-kezelt lymphosarcoma sejtek
Teljes méretű kép
Az MT-I mRNS Northern-blot elemzése 5-AzaC-kezelt sejtekben, majd 5-AzaC hiányában növesztette. Az 5-AzaC-vel (+ 5-AzaC) kezelt és ezt követően gyógyszermentes táptalajban (± 5-AzaC) növesztett sejteket 3 órán át 50 μM ZnSO 4-vel kezeltük. Az ezekből a sejtekből származó teljes izolált RNS-t (30 μg) Northern blot-analízisnek vetettük alá MT-I vagy GAPDH mint próbaként az 1. ábrán leírtak szerint. Az 1. és 2. sáv a kezeletlen vagy cinkkel kezelt + 5-AzaC sejtek RNS-ét mutatja. a 3. és 4. sáv a kezeletlen és cinkkel kezelt ± 5-AzaC sejtek RNS-ét jelöli
Teljes méretű kép
vita
Kimutatták, hogy a demetilezőszer, az 5-AzaC, két thymoma sejtvonalban, az S-49-ben és a W-7-ben represszálja az MT-I gént (Compere és Palmiter, 1981). Ezekben a tanulmányokban azonban nem vizsgálták, hogy a szülői sejtek (thymus) képesek-e MT-t indukálni a nehézfémekre reagálva, és hogy az MT-I promóter reaktivációja az 5-AzaC promóterre gyakorolt közvetlen hatásának vagy demetilezésnek és az azt követő aktivációnak tudható be gén-specifikus transzkripciós faktor. Ha az MT-I promotert hipermetilezzük, az aktív és inaktív állapotban lévő metilációs helyek jellegét nem határoztuk meg. Ezen tanulmányok egyike sem számolt be arról, hogy az MT gének promótermetilezéssel történő elhallgattatása a tímuszból származó daganatok jellemzője. Eredményeink azt mutatják, hogy az MT-I gén néma a limfoszarkóma sejtekben, de a csecsemőmirigyben nincs a CpG-szigetek metilációja miatt a promóterben vagy a promóterhez közeli régióban. Nemrégiben azt is megfigyeltük, hogy az MT-I gén metiláció miatti elnémítása nem korlátozódik a limfocitákból származó daganatokra (K Ghoshal és ST Jacob, nem publikált adatok). Ezek a megfigyelések azt sugallják, hogy a daganatfejlődés egy bizonyos szakaszában az MT-I promóter hajlamos a metilezésre DNS-metil-transzferáz (DNS-MTáz) által. Nem ismert, hogy miért csak a CpG-szigeteket tartalmazó bizonyos gének specifikusan metilálódnak a daganatokban.
Feltűnő megfigyelés volt a P1798 sejtek folyamatos reakciója a nehézfémekre annak ellenére, hogy az 5-AzaC megvonódott az első demetilezés után, és a sejtek növekedése akár tíz megduplázódási idő alatt is megtörtént. Ezek az adatok alátámasztják azt az elképzelést, hogy a de novo metiláz nem nagyon aktív ezekben a limfoszarkóma sejtekben. Lehetséges, hogy a de novo metiláz aktivitást átmenetileg indukálták a thymusból és a metilezett MT-I génből származó limfoszarkóma kialakulásának kezdeti szakaszában. Később a gén metilációs állapotát fenntartó metiláz örökítette meg, amely hemimetilezett DNS-t használ szubsztrátként (Szyf, 1996). Ha az 5-AzaC-kezelés után mindkét szál demetilezett, a fenntartó metiláz nem képes metilezni ezeket a CpG-dinukleotidokat. A közelmúltban bebizonyosodott, hogy a DNS-MTáz többféle formája keletkezik különböző szövetekben alternatív spliceléssel (Deng és Szyf, 1998). Bár ezen változatok funkciói még nem ismertek, valószínű, hogy a P1798 sejtek a fenntartó metilezést katalizáló formát expresszálják, de a de novo metiláz aktivitást nem.
A $ config [ads_text16] nem található
Úgy tűnik, hogy a sok daganatos sejtvonalban előforduló jelentősen magasabb metiláció a magasabb DNS-metil-transzferáz aktivitásnak köszönhető (Szyf, 1996). A DMA-MTáz közvetlen szerepét a tumor szaporodásában a cDNS túlzott expressziója mutatta ki ennek a fehérjének, amely sejttranszformációt eredményezett, az antiszensz RNS expressziója megakadályozta. Érdekes lenne összehasonlítani ennek az enzimnek a aktivitását és expressziós szintjét a thymusban és a lymphosarcomában. Megmértük számos tumor szupresszor gén, pl. PRb, p53, p16 expressziós szintjét is, amelyek metilációval hallgatnak a különféle daganatokban. Meglepő módon mindhármuk expresszálódik a lymphosarcoma sejtekben (C Dong és ST Jacob, publikálatlan adatok). Ebben az összefüggésben feltételezhető, hogy egy másik, a T-sejtekből származó daganatokra specifikus tumorszuppresszor gént a promóter metilezésével szuppresszálnak a P1798 sejtek. Alternatív megoldásként a metallotionein önmagában vagy egy másik tumorszuppresszorral együtt működhet ezeknek a rákos sejteknek a növekedés szuppresszoraként. Az ilyen irányú tanulmányok folyamatban vannak. Mindazonáltal ez a tanulmány meggyőzően bebizonyította, hogy az MT-I promoter hipermetilezése felelős kizárólag az egér limfoszarkóma sejtjeiben elfojtásáért.
Anyagok és metódusok
Sejtkultúra, kezelés 5-azacytidinnel és nehézfémekkel
Az egér lymphosarcoma P1798 sejteket Dr. AE Thompson, a texasi egyetem, Galvastone, USA adományozta. Ezeket a sejteket 25 mM HEPES-t (pH 7,2), 2 mM glutamint, 2% nátrium-hidrogén-karbonátot, 0,2 μM β-merkaptoetanolt és 5% marhahús magzati szérumot tartalmazó RPMI 1640 táptalajban növesztettük. A 0,5 × 106 ml-es sűrűségű sejteket 2,5–5 M M 5-azacytidinnel (Sigma) kezeltük 72–90 órán át, amíg a sejtek legalább egyszer meg nem osztódtak. A kontroll vagy 5-AzaC-vel kezelt sejteket 1 × 106/ml sűrűségben 3 órán át CdSO 4-gyel (15 μ M) vagy ZnSO 4-vel (50 μ M) kezeltük.
A teljes RNS izolálása és Northern blot elemzés
A teljes RNS-t 107 sejtből izoláltuk guanidinium-tiocianát-sav-fenol módszerrel (Chomczynski és Sacci, 1987). Harminc mikrogramm teljes RNS-t választottunk el formaldehid-agaróz (1,2%) gélelektroforézissel, és nejlonmembránra vittük, amelyet ezután hibridizáltunk egér véletlenszerűen alapozott, α-32P-dCTP-jelölt MT-I cDNS-sel vagy patkány-glicerinaldehid-3- foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) szonda gyors hibridizációs pufferben (Amersham) a gyártó protokolljának megfelelően.
Az egér MT-1 promóteréhez kötődő transzaktivátorok elektroforetikus mobilitási elmozdulása (EMSA)
A faktorok DNS-kötési aktivitását a limfoszarkóma sejtekből előállított S-100 kivonatban mértük a közzétett protokoll szerint (Ghoshal és Jacob, 1996). Erre a célra 10 μg kivonatot 0,1 - 0,5 ng 32 P-vel jelölt dezoxi-oligonukleotiddal inkubáltunk 10 m H HEPES-t (pH 7,9), 60 m M KCl, 5 m M MgCl 2, 0,5 m M tartalmazó pufferben. DTT, 10% glicerin és 1 μg poli (dI-dC). Az oligonukleotidokat α-32P-dGTP-vel és három másik dNTP-vel Klenow-val töltjük fel. Az MTF-1 és Sp1 aktivitásokat MRE-d oligóval mértük (Ghoshal et al., 1998Ghoshal et al., 1998). A kompetitív EMSA érdekében az extraktumot a jelöletlen versenytárs 100-szoros moláris feleslegével 15 percig jégen inkubáltuk, mielőtt a jelölt oligót hozzáadtuk volna. A reakcióelegyet 30 percig jégen inkubáltuk, és a DNS-fehérje komplexet poliakrilamid (4% akrilamid) gélelektroforézissel elválasztottuk. Az alkalmazott dezoxi-oligonukleotidok felső szálának szekvenciája a következő: (1) MRE-d oligo (Sp 1 és MTF-1 esetében) 5′-G ATCC AGGGAGCTCT GCACTCCG CCCGAAAAGTA; (2) MRE-s oligo (MTF-1 esetében) 5′-GATCCAGGGAGCTCTGCACACGGCCCGAAAAAGTA; (3) MLTF/ARE (az MLTF esetében) 5′-GATCCGCGGGGCGCGTGACTATGCGTGGGCTGGA; (4) MLTF (az MLTF számára) 5′-CACCCGCACGTGCCTACACC.
Az MT-I promoter biszulfit genomiális szekvenálása limfoszarkóma sejtekben a metilezett citozin maradékok meghatározásához
Az MT-I promóter biszulfit szekvenálásához limfoszarkóma sejtekben vagy egér csecsemőmirigyben Clark és munkatársai módszerét követtük. (1994), bizonyos módosításokkal, a citozinok uracillá történő teljes átalakulásának elősegítése érdekében, a metil-citozinok változatlanok maradnak. A limfoszarkóma sejtekből és az egér csecsemőmirigyéből izoláltuk a DNS-t, és 0,3 M NaOH-val (frissen készített) denaturáltuk (5 μg) 37 ° C-on 30 percig. A denaturált DNS-hez frissen előállított (0,35 M) hidrokinont tartalmazó 2,35 M nátrium-metabiszulfit-oldatot adunk, és húszszor forgatjuk ciklusban termikus ciklusban 50 ° C-on 30 percig és 95 ° C-on 2 percig. A biszulfittal kezelt DNS-t Wizard DNS Clean Up kit (Promega) segítségével sótalanítottuk, 50 mM NaOH-dal 37 ° C-on 30 percig deszulfonáltuk, nátrium-acetáttal (pH 4,5) (0,2 M, végső koncentráció) semlegesítettük és a Wizard alkalmazásával tisztítottuk. DNS Clean Up készlet. Az átalakított DNS alikvot részét használtuk az MT-I promoter amplifikálásához. A biszulfittal konvertált MT-I gén felső szálának amplifikálásához használt primerek a következők: A PCR első körében (m = egér): mMTI-S1: 5′-TAGAGTAGATGGGTTAAGGTGAGTG; mMTI-A1: 5′-ATCCCCACTTAATATTCTAAAAACC. Beágyazott PCR esetén: mMTI-S2: 5′-AGGAGTAGAGAATAATGTTGAGATGAGT; mMTI-A2: 5′-CTTAAAAAACAACCTACCCTCTTTATAAT (izzítási hőmérséklet, 60 ° C).
A biszulfit reakció hatékonyságának teszteléséhez először az amplifikált DNS-t (500 bp) emésztettük Apo I (G/C ↓ AATT ↑ A/T) és Tsp509 I (↓ AATT ↑) restrikciós enzimekkel, amelyek csak az átalakult, de nem a fedetlen DNS. E két enzim restrikciós helyei csak akkor keletkeznek, amikor a C-csoportokat átalakítják T-maradékokká. A biszulfit konverzió befejezését az amplifikált DNS Apo I vagy Tsp509 I alkalmazásával történő teljes emésztése igazolja. Ezután a lymphosarcoma sejtekből és a csecsemőmirigyből származó PCR termékeket fmol szekvenáló rendszerrel (Promega) szekvenáltuk beágyazott PCR primerekkel, valamint a belső 5 'primerrel. -TTGGGGAAAGTATTATAGGGATATGATG a felső szálhoz. A biszulfittal kezelt DNS-ben csak metilezett citozinok lesznek szekvenálva Cs-ként, és a konvertált nem-metilezett C-szekvenciák Ts-ként. A biszulfit genomi szekvenálást olyan kromoszomális DNS-sel is elvégeztük, amely a 2,5 µM 5-AzaC-val 72 órán át kezelt sejtekből származik, amelyek MT-1-et expresszálnak nehézfémekre reagálva.
A limfoszarkóma sejtek egér MT-I génjének promóter régiójának in vivo genomi lábnyomelemzése az 5-AzaC-val végzett demetilezés előtt és után
A sejtes DNS in vivo metilezését és a DNS extrahálását Mueller és Wold (1989) írták le. Az érdekes DNS-szekvenciát ligálás által közvetített PCR-rel (LM-PCR) amplifikáltuk Meuller és Wold eljárása szerint, Ping és mtsai. (1996). Röviden, az eljárás magában foglalja a táptalajban (RPMI) lévő lymphosarcoma sejtek 2 percig szobahőmérsékleten dimetil-szulfátnak (1 μl/ml) való kitettségét, majd a genomi DNS tisztítását. A metilált DNS-t ezután metil-guanin helyzetben, 10% -os piperidinnel 90 ° C-on 30 percig hasítottuk. A megtisztított, hasított DNS-t (2 μg) ezután LM-PCR-nek vetettük alá, hogy elemezzük az MRE szekvenciák és az MLTF/ARE lábnyomát egér MT-I promoter-specifikus primerekkel, a korábban leírtak szerint (Mueller és Wold, 1989). Az alsó szál LM-PCR-jéhez használt primerek a következők: (1) 5′-GAGTTCTCGTAAACTCCAGAGCAGC; (2) 5′-CAGAGCAGCGATAGGCCGTAATATC; (3) 5′-GATAGGCCGTAATATCGGGGAAAGCAC.
köszönöm
A szerzők hálásak Aubrey Thompsonnak és Richard Palmiternek az egér lymphosarcoma P1798 sejtek és az egér MT-I minigénjének biztosításáért. Ezt a munkát részben az USPHS CA61321 támogatása támogatta ST Jacob számára, és az ACS intézményi kutatási támogatása K Ghoshal számára.