elemeket
absztrakt
A hepatocelluláris carcinoma (HCC) az ötödik leggyakoribb rosszindulatú daganat és a második legfontosabb oka a rákkal kapcsolatos halálnak1. Sok erőfeszítést tettek a HCC-ben szenvedő betegek klinikai kezelésének javítására; A HCC jelenlegi prognózisa azonban gyenge, elsősorban a magas áttétképződés és a kiújulás miatt, ami alacsony teljes túléléshez vezet 2. A hatékony terápiás szerek hiánya megköveteli az előrehaladott HCC kezelésére szolgáló új gyógyszerek sürgős fejlesztését.
Az anizomicin a Streptomyces griseolus 15, 16 által termelt antibiotikum. Érdekes módon az anizomicinről kimutatták, hogy gátolja az eukarióta fehérjeszintézist és a DNS-szintézist, és arról számoltak be, hogy közvetlen elpusztító hatással rendelkezik a tumorsejtek több típusára 17, 18. Az anizomicin immunrendszerhez kapcsolódó tumorellenes hatások hátterében álló mechanizmusokat azonban nem vizsgálták.
az eredmény
Az anizomicin hatékony közvetlen citotoxikus ágensként hat a HCC sejtekkel szemben
Habár az anizomicin tumorellenes citotoxikus hatásáról (lásd a kémiai szerkezetet az 1a. Ábrán) korábban beszámoltunk a 17, 18-ban, az anizomicin közvetlen citotoxikus képességét a HCC sejtekben nem írták le. Így megvizsgáltuk az anizomicin citotoxicitását számos HCC sejtvonalban. Ennek az állapotnak az értékeléséhez megmértük az anizomicin közvetlen hatásait a HepG2, Huh7 és SNU449 sejtek életképességére és proliferációjára EZ-Cytox Enhanced sejt életképességi tesztekkel. Az anizomicin által közvetített sejtes citotoxicitás felére eső maximális gátló koncentráció (IC50) értékeit a megfelelő koncentráció-válasz görbékből számoltuk. Fontos, hogy a HepG2, Huh7 és SNU449 sejtek egyaránt érzékenyek voltak az anizomicinre (a HepG2, Huh7 és SNU449 sejtek IC50-értékei: 82, 2, 118 és 138 nM; 1b-d. Ábra). Eredményeink arra utalnak, hogy az anizomicin rendkívül hatékonyan gátolja a HCC sejteket. Az anizomicin citotoxikus hatásainak igazolásához megvizsgáltuk a HepG2, Huh7 és SNU449 sejteket 0,2 μM anizomicinnel végzett 2 napos tenyésztés után. Megállapítottuk, hogy az anizomicin fénymikroszkóppal megfigyelve csökkentette a HepG2, Huh7 és SNU449 sejtvonalak sejtsűrűségét (1e. Ábra).
Az anizomicin gátló hatása a HCC sejtekre. a ) az anizomicin kémiai szerkezete; A sejtproliferáció% -os gátlása az anizomicin kezelés miatt ( ) HepG2, ( c ) Huh7 a ( d ) Meghatároztuk az SNU449 sejteket, és az adatokat három független kísérletből gyűjtöttük össze. A jelzett IC50 értékeket a koncentráció-válasz görbéből határoztuk meg. ( e A HepG2, Huh7 és SNU449 sejteket 48 órán át DMSO-val (kontroll) vagy 0,2 μM anizomicinnel kezeltük, és fényképeket készítettünk fénymikroszkóp alatt. Több mint három független kísérlet reprezentatív képe látható.
Teljes méretű kép
Az anizomicin az apoptózissal és az immunválaszhoz kapcsolódó gének szelektív expresszióját váltotta ki a HCC sejtekben
Az anizomicin apoptózist váltott ki és szabályozta az apoptózissal összefüggő géneket a HCC sejtekben. ( a ) Venn-diagramok bemutatva az apoptotikus folyamathoz kapcsolódó, differenciálisan expresszált gének száma és az anizomicinnel végzett kezelést követően a HepG2 sejtekben szabályozott immunválasz. A DAVID funkcionális annotációjának elemzésére használt 1821 gén közül 166 és 127 gént azonosítottak az apoptotikus folyamat és az immunválasz társult génjeiként. Mindkét oldalon 39 gén szerepelt. ( ) Az apoptózissal összefüggő gének expressziós szintjeinek termikus térképének ábrázolása, amelyet három független kísérletben a HepG2 sejtek anizomicinnel történő kezelése után több mint kétszeresen változtattak meg. A hőtérkép génjeinek listáját az 1. kiegészítő táblázat tartalmazza. ( c A HepG2, Huh7 és SNU449 sejteket 48 órán át előkezeltük DMSO-val (kontroll), 0, 1 és 0,2 μM anizomicinnel, majd az apoptózist áramlási citometriával elemeztük. -ADD (apoptotikus sejtek) három független kísérletből.
Teljes méretű kép
Az anizomicin által kiváltott apoptózis a HCC sejtekben
Az apoptózissal összefüggő gének hőtérképe (2b. Ábra) azt mutatta, hogy 90 gén expressziója szabályozott volt, míg 76 gén expressziója csökkent (az 1. kiegészítő táblázatban szerepel). Így megpróbáltuk megerősíteni, hogy az anizomicin indukálta-e az apoptotikus sejthalált a HCC sejtekben. Először anizomicinnel kezelt HepG2 sejteket festettünk Annexin V-vel és 7-ADD-vel, majd áramlási citometriát végeztünk. Megállapítottuk, hogy az apoptotikus HepG2 sejtek (annexin V pozitív és 7-ADD pozitív) aránya nőtt az anizomicin koncentrációval (2c. Ábra). Az apoptózisra hasonló hatásokat figyeltünk meg a Huh7 és SNU449 sejtekben is anizomicinnel végzett kezelés után az 1. ábrán bemutatott koncentrációkban. 2c.
Az anizomicin in vitro növelte az NK-sejtek citotoxicitását a HCC-sejtekben
Az anizomicin NK-függő hatásai a HCC xenograft modellben. a ) A vizsgálat megtervezésének és az injekciós módszer sematikus diagramja a terápiás hatékonyság érdekében. ( ) A HepG2 sejtek beoltása után öt nappal anizomicint (10 mg/kg) adtak be 0-5 napig, és 15-20 nappal az intraperitoneális (ip) kezelés megkezdése után. Az NK-sejteket (5x106 sejt/egér) kétszer vittük át az egerekre a 6. és 11. napon a kezelés szüneteltetési ideje alatt, az Anyagok és módszerek szerint (n = 6 egér). A daganat méretét a jelzett napokon mértük. ( c ) Daganatok minden egércsoportban (n = 6) a kísérlet 23. napján. ( d ) Minden egércsoport (n = 6) testtömeg-pontjait 3 naponta mértük.
Teljes méretű kép
vita
Az anisomycin, a S. griseolus 15, 16-ból izolált természetes antibiotikum gátló hatást fejt ki az eukarióta riboszómákra, blokkolja a peptidil-transzferáz aktivitást 24. Az anizomicin ezen aktivitásai az eukariótákban befolyásolhatják a különféle sejtfunkciókat, például a fehérje expressziójának szabályozását, a túlélést és a proliferációt 18, 25, 26. Ezenkívül az anizomicin által közvetített hatások közvetíthetők az intracelluláris jelátviteli utak szabályozásával, például a mitogén-aktivált protein-kináz (MAPK) útvonal 26-mal, amely csökkenti a c-Fas doménnel (IL-1) konvertáló enzimhez társuló kaszpázinhibitort. gátló enzim fehérje (FLIP) és az 27., 28. aktivációs halál aktivációs útja, valamint a c-Jun és p-38 kináz aktivációja. Nyilvánvaló, hogy az anizomicin többféle rákellenes jelátvitelt vált ki a különböző rákos sejtekben, beleértve a HCC sejteket is. Az anizomicin által kiváltott jelátviteli utak a különböző sejtek között eltérhetnek a differenciált intracelluláris jelátviteli állványok miatt, amelyek a különböző sejtek között eltérnek. Bár még nem teljesen ismert, az anizomicin egyértelműen befolyásolja a sejt sejtes haláljelét.
A Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes alkalmazásával végzett genomi transzkripciós elemzésünk alapján megállapítottuk, hogy a HCC sejtekben található anizomicin számos jelátviteli utat befolyásolhat, beleértve a MAPK-t, a tumor nekrózis faktor receptort és a nukleáris faktor kappap jelátviteli útvonalakat. (az adatok nem láthatók). Az anizomicin intracelluláris jelátviteli utakra gyakorolt hatásai apoptózist indukálhatnak és elnyomhatják a HCC sejtek növekedését. Eredményeink azt mutatták, hogy az anizomicin számos HCC-sejtvonalban erősen gátolja a növekedést vagy a közvetlen citotoxicitást; ezen túlmenően az anizomicin ezen gátló hatásai az apoptózis HCC-sejtekben történő kiváltásának köszönhetők. Így az anizomicin által kiváltott több intracelluláris szignál változásai megmagyarázhatják a sejtek apoptózisát és citotoxicitását a HCC sejtekben.
Az immunhoz kapcsolódó gének közül azt is megállapítottuk, hogy a HepG2 sejtekben található CD46, Vav3, ITGB2, EMP2 és ECM1 géneket anizomicin szabályozta; ezekről a génekről korábban beszámoltak arról, hogy a különböző rákos sejtvonalak 33, 34, 35, 36 sejtjeinek metasztázisaiban működnek. Az anizomicin által szabályozott immun-asszociált gének másik fontos csoportja a KITLG, IL-6, IL-32 és IL-3RA, amelyek citokineket és citokinreceptorokat kódolnak, hogy közvetítsék a lehetséges túlélési vagy növekedési jeleket a daganatsejtekben. Fontos, hogy a legtöbb citokin és citokin receptor gént anizomicinnel kezelték HepG2 sejtekben. A citokinek és a citokinreceptorok alacsony szintű szabályozása elnyomhatja a citokinek vagy más növekedési faktorok működését, szinergikusan kiválthatja a túlélési jeleket a citokinnal összefüggő intracelluláris jelátviteli út gének, például a STAT5B, IRAK2, RELB és JAK3 csökkentésével .
mód
A NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl egereket a Charles River Laboratories, Inc.-től szereztük be. (Wilmington, MA, USA). Minden kísérletben 6-8 hetes nőstény egereket használtunk; ezeket az egereket kórokozóktól mentes állattartó létesítményben helyezték el. Valamennyi állatkísérletet a koreai Biológiai Tudományok és Biotechnológia Kutatóintézetének Koreai Állatvédelmi és Gondozási Intézménye hagyta jóvá, és az Egyesült Államok Nemzeti Egészségügyi Intézete által kiadott, a laboratóriumi állatok gondozására és felhasználására vonatkozó kézikönyvel összhangban hajtották végre.
Az xenograftok vizsgálata
6 hetes nőstény NOD.CB17-Prkdc scid/NCrCrl egereket a Charles River Laboratories, Inc.-től vásároltunk. A xenograft modelleket 1 x 106 HepG2 sejt szubkután injekciójával határoztuk meg az egerek jobb oldalsó részén. Öt nappal az oltás után az egereket véletlenszerűen négyes csoportokra osztottuk. Az anizomicint (10 mg/kg) az anizomicin-kezelés megkezdése után az intraperitoneális (ip) úton a 0–5. És a 15–20. Napon adtuk be. Az NK-sejteket (5x106 sejt/egér) kétszer vittük át az egerekre a 6. és 11. napon a kezelés szüneteltetési ideje alatt. A daganatokat 3 naponta mértük féknyergek segítségével, és térfogatukat a következő képlet alapján számítottuk ki: térfogat (mm3) = (d2xD)/2, ahol d és D a legrövidebb, illetve a leghosszabb tumorátmérőt jelenti,.
Az emberi perifériás vér és az NK sejtek osztályozása
Egészséges donorok perifériás vérét a Vöröskereszt vérközpontjából nyertük. Követtük a Vöröskereszt utasításait, és az emberi perifériás vér használatával járó összes módszert és protokollt jóváhagyta a Vöröskereszt Intézményi Felülvizsgálati Testülete. A Vöröskereszt irányelvei alapján tájékozott beleegyezést kaptak a vizsgálatban való részvételhez, és nem adtak adományozói információkat. Az NK-sejteket teljes vérből izoláltuk 95% -nál nagyobb tisztaságig, negatív szelekcióval RosetteSep Human NK sejtdúsító koktél (StemCell Technologies, Vancouver, Kanada) alkalmazásával, a gyártó protokollja szerint. Az izolált NK-sejteket HBSS-ben plusz 4% szarvasmarha-magzat szérummal (FBS; Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) mostuk és 20% FBS-t (Life Technologies) és penicillin-streptomycint (Life Technologies) tartalmazó MEM-ben (Life Technologies) szuszpendáltuk. ) 37 ° C-on 5% CO 2 -ban.
NK sejt citotoxicitási vizsgálat
Sejtkultúra és reagensek
A HepG2 sejteket az American Type Culture Collection-től (ATCC, Manassas, VA, USA), a Huh7 és SNU449 sejteket a Koreai Cell Line Banktól (Szöul, Korea) vásároltuk. A sejteket a szállító utasításai szerint tenyésztettük. A HepG2 sejteket Eagle Minimal Essential táptalajban (ATCC) tenyésztettük, amely 10% FBS-t (Life Technologies), 2 mM 1-glutamint és penicillin-sztreptomicint (Life Technologies) tartalmazott 37 ° C-on, 5% CO 2-ban. A Huh7 és SNU449 sejteket 10% FBS-t (Life Technologies), 2 mM 1-glutamint és penicillin-sztreptomicint (Life Technologies) tartalmazó RPMI1640-ben (Life Technologies) tenyésztettük 37 ° C-on, 5% CO 2-ban. Az anizomicint a Sigma-Aldrich-től (St. Louis, MO, USA) szereztük be, és 20 mg/ml koncentrációban oldottuk 100% DMSO-ban törzsoldatként. A törzsoldatot -20 ° C-on tároltuk, és minden kísérlet előtt tápközegben hígítottuk. A végső DMSO-koncentráció ebben a vizsgálatban nem haladta meg a 0,1% -ot (minden kontrollcsoport 0,1% DMSO-t kapott). A kaszpáz 3, PARP és β-aktin antitesteket a Cell Signaling Technology-tól (Danvers, MA, USA) szereztük be.
Microarray és adatelemzés
A sejtek életképességének és szaporodásának vizsgálata
A sejtproliferációt az ITSBIO (Szöul, Koreai Köztársaság) EZ-Cytox Enhanced sejtéletképesség-vizsgálati készletével értékeltük. Röviden: megfelelő számú sejtet helyeztünk egy 96-lyukú lemez minden egyes lyukába, és 48 órán át különböző koncentrációjú anizomicinnek tettük ki. Ezt követően tetrazóliumsó reagenst adunk hozzá, és a sejteket 2 órán át inkubáljuk. Az inkubáció végén az egyes mélyedések abszorbanciáját mikrolemez-leolvasóval mértük 450 nm-en. A sejtek relatív életképességét (%) az OD T/OD Cx 100% egyenlet felhasználásával számítottuk (ahol az ODT a gyógyszerrel kezelt csoportban az abszorpciót, az ODc pedig a kontroll csoportban az abszorpciót jelenti). Az átlagos gátló koncentrációt (IC50) a gyógyszer azon koncentrációjaként határoztuk meg, amely a sejtek 50% -ának gátlásához szükséges a kontrollokhoz képest. Az IC50 értékeket a koncentráció-válasz görbéből határoztuk meg.
Antitestek és áramlási citometria
Az apoptotikus sejtek elemzéséhez a sejteket humán CD56-allofikocianin (7ADD) és Annexin V (BioLegend, San Diego, Kalifornia, USA) monoklonális antitestekkel festettük a gyártó által megadott protokoll szerint. Röviden, a sejteket anti-humán anti-humán CD56-allofikocianin monoklonális antitestekkel festettük jégen 10 percig, megfelelő térfogatú lehűtött annek-sein V-t megkötő pufferrel (BioLegend) mostuk, és lehűtött annek-sein V hűtőpufferben (BioLegend) újraszuszpendáltuk. az annekdin V és a 7ADD jelenléte. A sejteket jégen inkubáltuk 30 percig, lehűtött annek-sein V-hez kötött pufferrel mostuk és elemeztük. A festési adatokat FACSCanto II citométer (BD Biosciences) segítségével gyűjtöttük össze.
Sejtválogatás
A HepG2 sejteket 0,2 μM anizomicin jelenlétében vagy távollétében tenyésztettük 2 napig, és a sejtek számához gyűjtöttük. Ezután 1x107 HepG2 sejtet együtt tenyésztettünk 1x107 NK sejtekkel 2 órán át, majd 1000 fordulat/perc sebességgel, 5 percig végzett centrifugálással gyűjtöttük össze. A sejteket anti-humán CD56 monoklonális antitestekkel (BioLegend) festettük, mostuk és 4% FBS-sel (Gibco) kiegészített HBSS-t tartalmazó PBS-ben reszuszpendáltuk. A CD56-negatív HepG2 sejteket majdnem 100% -os tisztaságig izoláltuk Aria citométerrel (BD Biosciences).
A teljes RNS és a valós idejű reverz transzkripciós polimeráz láncreakció (qPCR) izolálása
A sejteket a fent leírtak szerint állítottuk elő. A teljes sejtes RNS-t TRIzol-reagens (Invitrogen) alkalmazásával izoláltuk. A valós idejű RT-PCR-t RNS (20 ng) mint templát, qScript SuperMix cDNS alkalmazásával végeztük a fordított transzkripciós lépésben, valamint a PerfeCTa qPCR FastMix, UNG és ROX PCR alkalmazásával (Quanta Biosciences, Gaithersburg, MD, USA). Az alapozó- és szondakészleteket (FAM/VIC-jelöléssel) az Applied Biosystems-től (Waltham, MA, USA) szereztük be. Az eredményeket a TaqMan GAPDH kontrollreagensekkel (Applied Biosystems) detektált GAPDH-ra kapott értékek alapján normalizáltuk. A valós idejű QPCR-t duplikált mintákon végeztük az ABI 7700 szekvencia detektáló rendszer (Applied Biosystems) segítségével. Minden donortól származó sejtek esetében a 2-ACT értékeken alapuló relatív expressziós szinteket százalékban fejezzük ki a legmagasabb expressziójú alcsoporthoz kapott értékekhez viszonyítva.
Western blot elemzés
A sejteket módosított RIPA lízispufferben szuszpendáltuk (150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Triton X-100, 1% NP-40, 0,5% nátrium-deoxi-kolát, 0,1% nátrium-dodecil-szulfát [SDS] és 50% mM Tris- HCl [pH 7,4], amely proteáz inhibitor koktélt (Roche, Mannheim, Németország) és foszfatáz inhibitorokat (1 mM nátrium-fluorid és 2 mM nátrium-higany-acetát) tartalmazott jégen 30 percig, és 15 000 x g-vel 30 percig centrifugálták, hogy teljes sejt-lizátumokat kapjanak . A fehérjéket (10-20 ug) SDS-poliakrilamid gélelektroforézissel elválasztottuk 8-12% géleken, majd polivinilidén-difluorid membránokra vezettük (Millipore, Bedford, MA, USA). A Western blotot kaszpáz 3, PARP és β-aktin (Cell Signaling Technology) és primer peroxidázzal konjugált anti-egér vagy nyúl anti szekunder antitestek ellen végeztük. A fehérjéket Enhanced Chemiluminescence Plus reagensekkel vizualizáltuk (Amersham Biosciences, Piscataway, NJ, USA).
Statisztikai analízis
A varianciaanalízist többszörös összehasonlításhoz használtuk. Párosítatlan t teszteket végeztünk a két csoport közötti különbségek elemzésére. A statisztikai elemzéseket a Prism szoftvercsomaggal (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) végeztük. A 0,05 vagy annál kisebb p értékű különbségeket szignifikánsnak tekintettük.
köszönöm
Ezt a munkát a Nemzeti Kormány Tudományos és Technológiai Kutatási Tanácsának (NST) támogatásával támogatták (MSIP; CRC-15-02-KRIBB támogatás száma).
Elektronikus kiegészítő anyag
További információ
Hozzászólások
Megjegyzés beküldésével vállalja, hogy betartja Általános Szerződési Feltételeinket és közösségi irányelveinket. Ha ezt sértő cselekedetnek találja, amely nem felel meg feltételeinknek vagy irányelveinknek, kérjük, jelölje meg nem megfelelőnek.