Humán vastagbél- és végbélrákos p6c ​​sejtvonal létrehozása szár tulajdonságokkal

• absztrakt
• a cél:
• mód:
• az eredmények:
• következtetés:
• bevezetés
• az eredmény
• CD44-pozitív kolorektális rákos sejtvonalak generálása
• A P6C sejtek törzsgéneket expresszálnak
• A P6C sejtek önmegújítása és differenciálódása
• Kromoszomális instabilitás és mutációk a p53-ban a P6C sejtekben
• Egyetlen sejtből származó Holocone xenograft tumor
• A P6C sejtek gyógyszerrezisztenciája
• vita
• A szerző közreműködése
• További információ
• Képfájlok
• További kép S1
• További kép S2
• További kép S3
• További kép S4
• További kép S5
• További kép S6

absztrakt

A rák őssejtjei képesek megindítani és fenntartani a tumor növekedését. Ebben a tanulmányban létrehoztunk egy CD44 + kolorektális carcinoma őssejtvonalat, különös hangsúlyt fektetve az önmegújulás képességére, a fokozott daganatkezdeményezésre és a gyógyszerrezisztenciára.

mód:

Friss vastagbélrákot és párosított normál vastagbélszöveteket gyűjtöttünk 13 olyan betegnél, akik a műtét előtt nem estek át kemoterápián vagy sugárterápián. Az egyetlen sejtből származó 6 klón közül csak a P6C sejtvonalat tenyésztették több mint 20 passzálás során a soros tenyészetben, és nagy hatásfokú holoklonokat hoztak létre, majd a törzsek génexpressziója, a telepképződés, a tumorigenitás és a gyógyszer érzékenység a P6C sejtvonalon. vizsgálták.

az eredmények:

A fehérjetörzsek, köztük a c-Myc, Oct3/4, Nanog, Lgr5 és SOX2, erősen expresszálódtak a P6C sejtvonalban. Az Oct3/4-pozitív P6C sejtek többnyire szimmetrikus osztódással generálták a holoklonokat, míg a P6C sejtek kis száma aszimmetrikus osztódással generált merklont. A P6C sejtek stabilan expresszálták a CD44-et, és nagy képességük volt a tumor gömbök kialakítására. Egyetlen sejt gömb képes volt xenograft tumorok létrehozására meztelen egerekben. Az SW480 és a HCT116 kolorektális karcinóma sejtekhez képest a P6C sejtek rendkívül ellenállóak voltak a camptothecinnel és az 5-fluorouracillal szemben, amelyek a colorectalis daganatok kezelésében általában alkalmazott kemoterápiás szerek.

következtetés:

Kidolgoztunk egy vastagbél- és végbélrákos P6C őssejtvonalat, nagy tumorigén kapacitással és normál őssejtjellemzőkkel. Ez előnyös lesz a rákos őssejtek mechanikai vizsgálata és kifejezetten a rákos őssejteket célzó gyógyszerek kifejlesztése szempontjából.

az eredmény

CD44-pozitív kolorektális rákos sejtvonalak generálása

Összegyűjtöttük a vastagbélrák friss szöveteit és a normál vastagbélszöveteket párosítva 13 olyan betegnél, akik a műtét előtt nem estek át kemoterápián vagy sugárterápián. A szöveteket DMEM-ben őröltük, és 1 mg/ml kollagenázzal és 1 mg/ml hialuronidázzal inkubáltuk 1 órán át. A sejtszuszpenziót 25% 2 -es lombikba szélesztettük, amely 10% FBS-sel kiegészített DMEM-et és 5% FBS-t tartalmazó DMEM-t tartalmazó ultraibolya lemezeket tartalmazott. Nyolc beteg vastagbél- és végbélsejtjei gömböket képeztek ultravékony kötőedényekben (Corning, # 3262) 25 napig (1A. Ábra). Ezzel szemben ugyanazokban a tenyésztési körülmények között a normális vastagbél szöveteiből izolált sejtek nem képeztek gömböket. Ehelyett a normális vastagbélsejtek korlátozott sejtosztódáson estek át az öregedés előtt (1A. Ábra). Ezután izoláltuk az egyes rákos sejteket a gyöngyökből, és ezeket a sejteket lyukanként 0,5 sejt koncentrációban ültettük be egy 96 lyukú lemezre. Négy betegnél egy sejtből származó négy klónt (P6C, P7C, P8C, P13C-1, P13C-2 és P13C-3 néven) állítottunk elő. Ezek közül csak a P6C vonalat tenyésztették több mint 20 passzushoz a soros tenyészetben, és nagy hatásfokú 14, 15 holoklonokat képeztek (1A. Ábra).

90%, ha sejteket tenyésztettünk lemezeken (1D. Ábra). Ezzel szemben a differenciált bélhám-markerek, köztük a CDX2, a citokeratin 1 (CK1) és a CK20 expressziós szintje alacsony volt, amikor a sejteket szferoid tenyésztési körülmények között növesztették, és a kapcsolódás után jelentősen megnőtt. Ez arra utal, hogy a gömbökben lévő P6C sejtek megőrzik a differenciálatlan állapotot, és bizonyos fokú differenciálódáson mennek keresztül, amikor a kulturális körülmények változnak (1D. Ábra). A P6C sejtvonallal összehasonlítva az SW480 differenciált colorectalis carcinoma sejtvonal alacsony CD44 expressziót, magas CK20 expressziót mutatott, és pozitív volt a CDX2 expresszió szempontjából (1D. Ábra).

A jobb klónképződés a CSC egyik jellemzője. Amikor 100 sejtet implantáltunk egy 6-lyukú lemezre, azt figyeltük meg, hogy a P6C sejtvonalból több klón keletkezett, mint a HCT116 és SW480 sejtvonalakból; a klónok számában ez a különbség szignifikáns volt (1E. ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a P6C sejtvonal képes önmegújulásra és differenciálódásra, mindkettő őssejtjellemző.

A P6C sejtek törzsgéneket expresszálnak

Szárgén expresszió P6C sejtekben. (A) Az ősfehérjék immunfluoreszcenciája a tenyésztett P6C sejtekben. A P6C gömbjeit elkülönítettük, fedőlemezekre vetettük és 3 órán át hagytuk. A sejtek paraformaldehiddel történő rögzítése után a sejteket a jelzett antitestekkel inkubáltuk. A DAPI-t használták a magszámlálók festésére. Méret, 100 μm. (B) Stemness gén expresszió Western Western blot segítségével. A P6C sejteket stabilan transzfektáltuk a pOct3/4 promoter-EGFP (OPG) konstrukcióval. A HT29, HCT116, SW480, P6C és P6C-OPG sejtek teljes sejtlizátumát egyenletesen felvittük, SDS-PAGE-nak vetettük alá és nitrocellulóz membránokra vittük át. A membránokat ezután a jelzett antitestekkel inkubáltuk, és az ECL rendszer segítségével láthatóvá tettük. (C) A CD44 shRNS hatása az Oct3/4 expressziójára P6C sejtekben. Az Oct3/4 promoter relatív aktivitását GFP fluoreszcencia intenzitással mértük, amelyet áramlási citometriával detektáltunk. P6C-t és szülői sejteket használtunk kontrollként. Mindegyik mintát három példányban hajtottuk végre, és a kísérletet háromszor megismételtük. b P

A P6C sejtek szimmetrikus és aszimmetrikus megosztása. (A) Az Oct3/4 promóter aktiválása P6C és SW480 sejtekben. A P6C és SW480 sejteket stabilan transzfektáltuk a pOct3/4 promoter-EGFP konstrukcióval. Az Oct3/4 promoter aktiválódását és a CD45 expresszióját fluoreszcencia intenzitással mértük áramlási citométer segítségével. (B) Az Oct6/4 pozitív P6C sejt önmegújulása. Egy Oct3/4 pozitív P6C sejtet oltottunk egy 6-lyukú lemezre, és mikroszkóp alatt figyeltük meg. 24 óránként fényképeket készítettünk a holocén képződésének kimutatására. Méret, 50 μm. (C) Egy Oct3/4 pozitív P6C sejt aszimmetrikus osztódása Az egyik Oct3/4 pozitív P6C sejt meroklonja aszimmetrikus osztódáson ment keresztül a 2. stádiumú sejtekben. A képek 24 óránként készültek. Méret, 50 μm. (D) Az Oct3/4 pozitív sejtekből származó különböző meroklon, paraklon és holoklonok. A részleges pozitív Oct3/4 klón (tetején) sejtmorfológiája az Oct3/4 pozitív sejtek szoros tapadását és az Oct3/4-negatív relaxált kölcsönhatását mutatta sejtek. Két klón egymás mellett, jelezve, hogy a paraclon Oct3/4-negatív, a holoclone Oct3/4-pozitív (alsó). Méret, 200 μm.

Teljes méretű kép

• Töltse le a PowerPoint diát

Az össejtek jellemző tulajdonságai az önfelépülés és a differenciálódás. A P6C sejtvonalban betöltött szerepük megértése érdekében az egyes P6C-OPG sejteket beültettük egy 96 lyukú lemezre, és mikroszkóp alatt megfigyeltük osztódásukat. A legtöbb okt3/4-pozitív ráksejt szimmetrikus osztódáson ment keresztül, hogy GFP-pozitív holoklon sejteket képezzen (87%), amint azt a 3B. Ábra mutatja, míg a P6C sejtek csak 13% -a generált merklont aszimmetrikus osztódással (3C. Ábra). Kis százalék (

0,5%) az Oct3/4-negatív sejtekből képesek voltak diverzifikálódni Oct3/4-pozitív sejtekké ultravékony csészékbe beoltva (az adatokat nem mutatjuk be). Azt is észrevettük, hogy az Oct3/4 expresszió erősen korrelált a sejtmorfológiával. Valamennyi paraklon Oct3/4-negatív volt, míg az összes megfigyelt holoklon Oct3/4-pozitív sejtből állt. A meroklonban az Oct3/4-et expresszáló sejteket szilárdan tapadták, míg az Oct3/4-re negatív sejteket lazán érintkeztették, ahogy azt fáziskontraszt mikroszkóp alatt megfigyelték (3D ábra). Ezek a megfigyelések tovább támasztják azt a hipotézist, miszerint a P6C sejtek kritikus önmegújítási és differenciálódási tulajdonságokkal rendelkeznek. Ezenkívül az Oct3/4 olyan kolorektális CSC-k markere lehet, amelyek nagyobb potenciállal rendelkeznek a szimmetrikus osztódáson, mint azt korábban javasolták 16 .

Kromoszomális instabilitás és mutációk a p53-ban a P6C sejtekben

A rákos sejtek egyik legfontosabb jellemzője a normál sejtekhez képest a kromoszóma instabilitása, amelyet kritikusnak tekintenek a tumorgenezis megindulásában 17; azonban a genomiális instabilitás pontos szerepe a CSC-k elindításában továbbra is megfoghatatlan. Ezért érdekeltek voltunk a P6C sejtvonal genomiális integritásának vizsgálatában. Amint a 4A. Ábra mutatja, a P6C sejtek 73% -ának 59 kromoszómája volt. A 3., 4., 9., 13., 14. és 15. kromoszóma egy példánya, a 7., 12., 20. és 22. kromoszóma három kópiája volt. Ebben a sejtvonalban a kromoszóma transzlokációk is gyakoriak voltak, a kromoszóma inszerciók és deléciók mellett (4A. Ábra). Ezek az adatok azt mutatják, hogy a P6C sejtvonal kromoszóma instabilitásban és abnormális mitózisban szenved, amelyek a rákos sejtek közös jellemzői.

A p53 P6C sejtek kariotípusa és mutációi. (A) A P6C sejtek reprezentatív kariotípusa. A P6C sejtek körülbelül 73% -a 59 kromoszómával rendelkezett. Minden kromoszómát más színnel festettünk FISH-analízissel. (B) 72P-72R mutáció a P6C sejtek p53 alléljában (120. passzus). A p53 cDNS-t reverz átírással írtuk le az mRNS-ből, és szekvenálás előtt T-fény vektorba klónoztuk (felső). A C-G mutációt a Chromos Map (alul) igazolta. (C) 117 bp beépítése a P6C sejtekből származó p53 cDNS-be, aminek eredményeként 25 aminosav után korai stop kodon "TGA" keletkezik. (D) a P6C sejtek 4. és 120. passzusából származó p53 allélok. A CDNS-t reverz átírással írtuk le az mRNS-ből, és a p53 gént PCR-rel amplifikáltuk, mielőtt a T-vektorba inszertáltuk volna. A p53 allélok statisztikai elemzését úgy végeztük, hogy mindegyik mintából 10-22 konstrukciót szekvenáltunk.

Teljes méretű kép

• Töltse le a PowerPoint diát

A tumor szupresszor gének, például a p53 genetikai mutációja szorosan összefügg a rák iniciálásával. Arra voltunk kíváncsiak, hogy a CSC-k mutált p53 génnel rendelkeznek-e, ami összefüggésben lehet abnormális proliferációjukkal. A p53 gént a P6C sejtvonalból klónoztuk, és a szekvenciaelemzés kimutatta, hogy 72P-R mutánsok fordulnak elő a 4. és 120. passzus 60% -ában, illetve 67% -ában (4B. Ábra, 4D). Találtunk továbbá egy 117 bp méretű inszertációt a p53 cDNS-be; ez az inszerció 25 aminosav csonkolást eredményezett a p53 N-terminálisán (4C. ábra). Fontos, hogy azt tapasztaltuk, hogy a p53 gén mutációi hasonlóak voltak mind az alacsony passzázsú sejtekben (4. passzázs), mind pedig a magas passzázsú sejtekben (120. passzázs), ami erősen arra utal, hogy ezek a mutációk in vitro sejttenyésztési körülmények miatt nem halmozódtak fel 4D). ). Ezek az adatok azt a lehetőséget is alátámasztják, hogy bizonyos őssejtekben lévő mutációk CSC-k kialakulásához vezethetnek, amint azt már javasoltuk.

Meghatároztuk a P6C sejtek proliferációs sebességét az egyrétegű tenyészetben a sejtek növekedési sebességének kiszámításával is. Amint az az 5. ábrán látható, a P6C sejtek megduplázódási ideje kb

20 óra, hasonlóan az SW480 és HCT116 sejtvonalakhoz (P> 0,05). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a P6C sejtek hasonló proliferációs tulajdonságokkal rendelkeznek a differenciált vastagbélrákos sejtvonalakkal, ha sejtkultúra-csészékben tenyésztik őket.

Egyetlen sejtből származó Holocone xenograft tumor

Ezután azzal a kérdéssel foglalkoztunk, hogy egyetlen P6C sejt vezethet-e xenograft tumorhoz, amely a CSC jellemzője. A meztelen egereknek kb. 500 sejtet tartalmazó egysejtű holoklonokat injektáltak. Meglepő módon a xenograft tumorok 100% -os előfordulással kezdődtek (6/6). Ezután disszociáltuk és tripszinizáltuk meztelen egerekből az egyes sejtből származó szekunder klónok regenerálását. A szekunder klónok, körülbelül 500 sejt ismételt injektálása meztelen egerekbe szintén a tumor iniciálásának 100% -os előfordulását eredményezte. Ezek az adatok azt az elképzelést is alátámasztják, hogy a P6C sejtek képesek önmegújulásra és in vivo differenciálódásra .

A CSC-vonal egyik előnye, hogy ideális rendszert biztosít a tumor progressziójának in vivo nyomon követésére. Ehhez a stratégiához előjelöltük a P6C-OPG sejteket DsRed-del és tisztított kettős pozitív sejtekkel FACS-mal (5A. Ábra). DsRed/GFP kettős pozitív holoklont választunk ki, és meztelen egerekbe ültetjük őket (5B. Ábra). A daganat fejlődését teljes test fluoreszcencia képalkotásával vizualizálták, az 5C. Ábra szerint. A GFP immunhisztokémia feltárta, hogy bizonyos Oct6/4-pozitív P6C sejtek differenciálódtak Oct3/4-negatív sejtekké xenograft tumorokban. A CD44 és az Oct3/4 együttes lokalizációját soros szakaszok festésével detektáltuk. Érdekes módon a CD44 és az Oct3/4 kettős pozitív sejtek az elsődleges rákokhoz hasonló xenograft tumorok csoportjaiban helyezkedtek el (5D. Ábra).

Egyetlen P6C sejtklónból származó daganatok képalkotása. (A) A DsRed-jelölt P6C-OPG sejteket FACS-rendszer szerint rendeztük. A P6C-OPG sejteket DsRed konstrukcióval transzfektáltuk és FACS-mal elemeztük. GFP/DsRed kettős pozitív sejteket szétválasztottunk tenyésztőedényekben történő szaporítás céljából. (B) GFP/DsRed kettős pozitív klónok. A DsRed stabilan expresszálódott a P6C-OPG klónból származó egyik sejtben. Méret, 200 μm. (C) DsRed-jelölt P6C-OPG holoklonokból indított xenograft tumorok meztelen egerekben. A tumorokat teljes test fluoreszcencia képalkotásával (in vivo FX PRO, Carestream) detektáltuk, és relatív fluoreszcencia intenzitást mutattak d 0 és 30 dátumnál. (D) A xenograft tumorok immunhisztokémiája. A tumorokat paraffinban rögzítettük, és CD44 és GFP antitesteket használtunk a CD44 és az Oct3/4 expressziójának kimutatására.

Teljes méretű kép

• Töltse le a PowerPoint diát

A P6C sejtek gyógyszerrezisztenciája

Felvetődött, hogy a CSC-k képesek gyógyszerrezisztenciát biztosítani és hozzájárulnak a rák kiújulásához. Ezért arra a kérdésre törekedtünk, hogy a P6C-k rezisztensek-e a kemoterápiás szerekkel szemben. A camptothecint (CPT) és az 5-fluorouracilt (5-FU) általában használják kemoterápiás szerek a vastagbélrák kezelésében. A HCT116 és SW480 sejtekhez képest azt tapasztaltuk, hogy a P6C sejtek kevésbé voltak érzékenyek a CPT és az 5-FU iránt (6A, 6B. Ábra; További 6A. Ábra). A sejtszaporodás gátlásának hiánya mellett a P6C sejtek nagyon ellenállóak voltak az 5-FU által indukált apoptózissal szemben, amint azt az Annexin V/PI festés mutatja (6B., 6C. Ábra; További 6B. Ábra). Mivel a leggyakrabban alkalmazott kemoterápiás szerek a sejtciklus leállításán keresztül működnek, megvizsgáltuk, hogy az 5-FU befolyásolta-e a sejtciklust. Meglepetésünkre a P6C sejtek kevésbé voltak érzékenyek az 5-FU által indukált S-G2 ellenőrzési pontra az SW480 sejtekhez képest, az SW480 sejtekhez képest. Bár a sejtciklus leállítása 48 órán át folytatódott, ez a hatás 72 órán keresztül gyengült (6D. Ábra). Ezek az adatok arra utalnak, hogy a CSC-ben van egy egyedi ellenőrzési pont a sejtciklusban, ami gyógyszerrezisztenciához vezet.

A P6C sejtek kemorezisztenciája. (A) 2 μmol/l kamptotecinnel kezelt P6C, HCT116 és SW480 sejtek morfológiai megfigyelése. A sejtmorfológiát 24 és 48 óra elteltével mikroszkóp alatt figyeltük meg. Méret, 100 μm. (B) Az 5-FU indukálta a P6C és SW480 sejtek sejthalálát. A sejteket 1 ug/ml 5-FU-val kezeltük a megadott ideig, majd tripszineztük. Az Annexin V-vel és PI-vel történő festést követően áramlási citometriás elemzést végeztünk. (C) Az 5-FU által indukált sejthalál statisztikai elemzése. A P6C és SW480 sejteket 0, 1, 1 és 10 μg/ml 5-FU-val kezeltük a megadott időpontokban. A sejtpusztulást a PI + sejtek áramlási citometriával meghatározott százalékában számítottuk. Ezt a kísérletet háromszor megismételtük. c P 18, 19, 20. Egy korábbi jelentés azt is kimutatta, hogy az OCT4 gén helytelen expressziója jelentős béldiszpláziát eredményezett 21. Harmadszor, bebizonyítottuk, hogy az egyetlen sejtből nyert gyöngyök vagy holoklonok a meztelen egerekben a xenograft tumor 100% -os előfordulását eredményezték. Végül, és ami fontos, megmutattuk, hogy a P6C-k önmegújuláson és differenciálódáson eshetnek át. Mindkét funkció kulcsfontosságú a CSC-k daganattá válásában.

A szerző közreműködése

Guan-hua RAO immunvizsgálatokat végzett és részt vett egy sejtvonal létrehozásában Xiao-hui WANG, Jun WANG és Hai-jing JIN segítségével; Hong-min LIU sejttanulmányokat végzett, részt vett a sejttenyésztésben és készített egy kéziratot; Bao-wei LI és Yan-lei YANG tumormintákat vett, tumorigenitási vizsgálatokat végzett; Jia-jie HAO és Ming-rong WANG genetikai vizsgálatokat végzett; Quan CHEN megtervezte a kísérleteket és kidolgozta a kéziratot; és a Lei DU molekuláris vizsgálatokat és statisztikai elemzéseket végzett, részt vett a kísérlet tervezésében és készített egy kéziratot.

További információ

Képfájlok

További kép S1

Az anti-CD45, anti-CD31 és anti-CD24 antitestek kontrolljai.