A vérképző sejtek bdnf-t termelnek és szabályozzák az étvágyat a természetes hipotalamuszba való vándorlás után

• elemeket
• absztrakt
• bevezetés
• az eredmény
• A koplalás a hematopoietikus sejtek migrációját indukálja a PVN-be
• A hematopoietikus sejtek jellemzői a PVN-ben
• A BDNF-et expresszáló mikroglia érintkezik a PVN neuronokkal
• A BM-specifikus BDNF-delécióval rendelkező egerek hiperfágok és elhízottak
• A BMT megmenti a BDNF hiány metabolikus rendellenességeit
• vita
• mód
• Állatkísérletek és in vivo
• Immunhisztokémia és immunelektron mikroszkópia
• Lézeres befogás mikrodisszekció és RNS izolálás
• Mennyiségi RT - PCR
• DNS mikroarray
• Hidrolízis szondák RT - PCR - ben BDNF variánsokhoz
• Mononukleáris sejtek intracerebroventrikuláris injekciója
• Statisztikai analízis
• További részletek
• További információ
• PDF fájlok
• További információ
• Hozzászólások

elemeket

• Vérképző őssejtek
• hipotalamusz
• Neurotrop faktorok
• Elhízottság

absztrakt

Az agyi neurotróf faktor (BDNF) elnyomja a táplálékfelvételt azáltal, hogy a hipotalamusz neuronjaira hat. Itt megmutatjuk, hogy a BDNF-t termelő vérképző sejtek szabályozzák az étvágyat és az energiaegyensúlyt azáltal, hogy a hipotalamusz paraventricularis magjába vándorolnak. Ezek a hematopoietikus paraventricularis sejtek mikroglia markert termelnek, és táplálékfelvételre reagálva közvetlen kapcsolatot létesítenek az idegsejtekkel. A veleszületett BDNF-hiányban szenvedő egerekben, különösen a vérképző sejtekben, hyperphagia, elhízás és inzulinrezisztencia alakul ki. Ezeket a rendellenességeket a csontvelő transzplantációja enyhíti vad típusú csontvelő sejtekkel. Továbbá a harmadik kamrába injektálva a vad típusú csontvelő mononukleáris sejtek otthon maradnak a paraventrikuláris sejt számára, és megfordítják a BDNF-hiányos egerek hiperfágiáját. Eredményeink egy új táplálkozási kontroll mechanizmust javasolnak, amely a vérképző sejtekben a BDNF termelésén alapul, és az elhízás lehetséges új terápiás kezeléseire mutatnak rá.

Az agyi neurotróf faktor (BDNF), amely a neurotrofin család tagja, széles körben expresszálódik az agyban, beleértve a kulcsfontosságú hipotalamusz magokat, amelyekről ismert, hogy fontosak az energiaegyensúly 1 szabályozásában, és a perifériás szövetekben, beleértve az izom-, a máj-, a zsírszövetet és a vérképző sejteket . 2, 3, 4. A BDNF a neurotróf hatásban betöltött szerepe mellett az energia homeosztázis központi szabályozója. A BDNF intracerebroventrikuláris infúziója rágcsálókban csökkenti az etetést és a testtömeget 5, 6. Ezzel szemben azoknál az egereknél, amelyekből hiányzik a Bdnf gén másolata, hyperphagia és elhízás alakul ki 7, 8. Emberekben a BDNF 9 genetikai haploinfektivitása, a TrkB-receptort kódoló gén mutációi (NTRK2) 10, valamint a 11, 12 asszociációs vizsgálatok együttesen vonják be a BDNF-et a táplálékbevitel szabályozásába és az elhízás kialakulásába.

Az energiamérleg-szabályozáshoz szükséges BDNF-termelés eredetének azonosítása érdekében a korábbi vizsgálatok vagy az egész agyi idegsejtekre, vagy a hipotalamusz specifikus magjaira összpontosítottak 13. Tekintettel a legújabb megállapításokra, miszerint a hematopoietikus sejtekben az agyszövetek találhatók, és hogy a hematopoietikus sejtek gazdag BDNF 2, 3, 4-et expresszálnak, megvizsgáltuk, hogy az agyszöveteknek otthont adó hematopoietikus sejtek által termelt BDNF részt vesz-e az energiaegyensúly és az étvágy szabályozásában. .

az eredmény

A koplalás a hematopoietikus sejtek migrációját indukálja a PVN-be

Nyolc hetes C57BL/6 egerek teljes test besugárzást (9 Gy) és csontvelő transzplantációt (BMT) (BMT) kaptak zöld fluoreszcens fehérjével (GFP) transzfektált C57BL/6 egerekből 14. Nyolc héttel később megszámoltuk a GFP-ből származó sejtek számát a hipotalamusz különböző magjaiban, különböző táplálkozási körülmények között (La-c. Ábra). Megállapítottuk, hogy a BM eredetű hematopoietikus sejtek a hipotalamuszhoz kötődtek, konkrétan a paraventrikuláris magban (PVN), az evés és ivás telítettségének központjában. Érdekes módon az éhezés (16 vagy 24 óra) jelentősen megnövekedett GFP + sejtek számát eredményezte a PVN-ben (1b. Ábra); a szám ismételt beadást követően 4 órán belül visszatért az alapvonalra 16 órás böjt után (1c. ábra). A GFP + sejtsűrűség nem változott szignifikánsan a többi vizsgált hipotalamusz magban (1d. Ábra).

A GFP + sejtek 40% -a transzformáló növekedési faktor-β-t produkált (S1b kiegészítő ábra), egy mikroglia-eredetű faktor, amely elősegíti az idegsejtek túlélését 17 .

A hematopoietikus sejtek jellemzői a PVN-ben

A BM-specifikus BDNF-delécióval rendelkező egerek hiperfágok és elhízottak

a ) A BMDC-specifikus BDNF (BM-BDNF -/-) veleszületett deléciójának előállítására szolgáló stratégia vázlata a Bdnf tm3Jae/J és a B6.129P2-Lyzs tm1 (cre) Ifo/J genotípusok keresztezésével. Az 1. és 2. láncindítót a genomi DNS kimutatására tervezték. A 3. és 4. láncindítót az mRNS kimutatására terveztük. ( ) BDNF és Iba1 immunfestése PVN BM-BDNF -/- és kontroll LysM-cre egerekben (BM-BDNF +/+). A nyíl a BDNF és az Iba1 festésének együttes lokalizációját jelzi a BM-BDNF +/+ sejtekben, a nyíl pedig az ilyen ko-lokalizáció hiányát a BM-BDNF -/- sejtekben. Méret, 10 μm. ( c ) A BDNF festés és a GFP expresszió ko-lokalizációs elemzése GFP-TG/BM-BDNF -/- sejtekben. A GFP-TG/BM-BDNF -/- egereket GFP-TG és BM-BDNF -/- egerek keresztezésével hoztuk létre. A BDNF nem volt lokalizálva a GFP-vel a GFP-TG/BM-BDNF -/- sejtekben. Méret, 10 μm. d ) A BM-BDNF genomikai elemzése -/-. Az 1,3 kb méretű BDNF gént a mononukleáris sejtekben és a GFP-TG/BM-BDNF -/- egerek PVN-jéből LCM-mel nyert mononukleáris sejtekben és GFP-pozitív sejtekben töröljük. ( e ) BDNF mRNS expresszió. A BDNF mRNS-t nem expresszáltuk GFP-pozitív sejtekben, amelyeket PVM egerekből nyertünk GFP-TG/BM-BDNF -/- LCM-mel.

Teljes méretű kép

( a - c ) A testtömeg összehasonlítása ( a ), táplálékbevitel ) és a vízbevitel ( c ) a BM-BDNF -/- és a kontroll Cre (BM-BDNF +/+) egerekben (n = 10). Felső: férfi, alsó: nő. d ) A glükóz- és inzulinszintek és a megfelelő AUC összehasonlítása az intraperitoneális GTT-ben BM-BDNF -/és kontroll Cre egerekben (n = 8-11). GTT, glükóz tolerancia teszt; AUC, a görbe alatti terület. e ) O-BM-BDNF -/- fogyasztása a Cre kontroll egerekhez képest világos és sötét időszakban (n = 12). Minden adat a ± sd * P átlagot jelenti

( a - c ) Testsúly ( a ), táplálékbevitel ) és a vízbevitel ( c ) BM-BDNF -/- egerekben, akik BMT-t kaptak BM-BDNF +/+ vagy BM-BDNF -/- egerekből (n = 10). Felső grafikonok: férfi, alsó: nő. d ) A glükóz- és inzulinszint és a görbe alatti terület (AUC) 5 hónappal a BMT után ugyanazokban a csoportokban, mint a GTT-ben (n = 5-6). e ) fogyasztása 2 6 hónappal a BMT után ugyanazokban a kísérleti csoportokban, mint ben a (n = 9). Az élelmiszer-bevitel változásai ( f ) és a víz ( g ) mononukleáris sejtek intracerebroventrikuláris injekciója után (n = 4-6). Adatok: átlagosan 7 nappal a sejtinjekció után. ( h ) Az injektált GFP-pozitív sejtek mikroszkópos elemzése PVN-ben. Bal oldali panel: A GFP-Tg/BDNF +/+ egerekből izolált BM-MNC-ket injektáltuk a BM-BDNF -/- egerek harmadik kamrájába (3 V). Jobb panel: GFP-Tg/BDNF -/- egerekből izolált BM-MNC-ket injektáltunk. Nyíl: GFP-pozitív sejtek. Méret, 50 μm. Minden adat átlag ± ± sd * P + P = 0,06, + P = 0,08.

Teljes méretű kép

Mivel monociták és makrofágok vannak jelen több szervben 27, a BDNF gén delécióját a LysM promóter által vezérelt Cre aktivitásra reagálva nem kell korlátozni az agy mikroglia sejtjeire. Ezért összehasonlítottuk a GFP-TG/BDNF +/+ vagy GFP-TG/BM-BDNF -/- egerekből izolált sóoldat vagy BM-MNC injekció hatásait a BM-BDNF -/- egerek harmadik kamrájába. Az intracerebrovaszkuláris injekció után egy viszonylag rövid, 8 napos időszak alatt jelentősen csökkent az élelmiszer-bevitel (5f. Ábra) és a vízfogyasztás (5g. Ábra) a GFP-TG/BDNF +/+ hematopoietikus sejtek BMT-ben részesültjeinél, donor eredetű GFP + BM sejtek detektálhatók voltak PVN recipiens egerekben (5h ábra).

vita

A tanulmányban bemutatott számos bizonyíték arra utal, hogy a hematopoietikus sejtekből származó BDNF ugyanolyan fontosnak tűnik, mint az idegsejtekből származó BDNF a felnőtt állatok étvágyának és elhízásának szabályozásában. Válaszul a PVN-nek otthont adó 16 órás gyors vérképző sejtekre, ahol számos mikroglia tulajdonságra tesznek szert és érintkezésbe lépnek a helyi idegsejtekkel. A BDNF hematopoietikusan specifikus variánsának előállításával ezek a BM-ből származó sejtek PVN-en keresztül szabályozzák az élelmiszer-bevitelt.

Fontos megjegyezni, hogy a BM-eredetű sejtek koplalással indukált PVN-be történő indukciója az egész testet besugárzó egerekben fejvédő hiányában vagy jelenlétében következik be. Maga a központi idegrendszeri besugárzás károsíthatja az agy érrendszerét, és lehetővé teszi a mikroglia prekurzorok rendellenes bejutását a keringésből a CNS 15, 16-ba. Megmutattuk azonban, hogy kísérleti körülményeink között csak enyhe és jelentéktelen növekedés volt tapasztalható (

A fej nélküli egerekben PVN-be vándorolt ​​BM-eredetű sejtek számának 17% -a), szemben a frontális pajzssejtekkel. Ezenkívül egy 16 órás gyors összehasonlítható növekedést okozott a PVN-t kiváltó hematopoietikus sejtek számában a fej által védett egerekben a nem védett besugárzott egerekhez képest.

A vérképző sejtek PVN-be történő migrációját serkentő jel jellege további vizsgálatot igényel. Érdekes módon a mikroarray elemzés feltárta, hogy az endotheliális és idegsejtek által termelt kemokin Cxcl2 mRNS-je> 30-szor magasabb volt az éhomi PVN-ben az etetett egereknél (S2 kiegészítő táblázat). A kemokinek és a citokinek részt vesznek a mikroglia vagy a BM-ből származó sejtek idegrendszerbe történő indukciójában, különösen az agyban bekövetkező sérülésekre vagy iszkémiára 17 vagy a gerincvelő sérülésére 29 reagálva. A Cxcl2 erős kemotaktikus aktivitást mutat a BM/hematopoietikus sejtek kereskedelmével szemben. Ezekben az állatokban megnövekedett PVN-expressziója 16 órán keresztül kiválthatja a BM-ből származó sejtek PVN-be történő migrációját.

Ez a kezdeti jelentés a hematopoietikus sejtek éheztetésével, amelyet éhezés váltott ki a PVN-en, a hipotalamusz magján, ahol az e sejtek által termelt BDNF negatívan szabályozhatja az étvágyat. A BM-ből származó BDNF in vivo hatékonysága nyilvánvaló azoknál a BM-BDNF -/- egereknél, amelyek képtelenek reagálni a PVD-ben lévő BDNF éhomi túltermelésére polidipszia, hiperfágia és elhízás formájában. Más laboratóriumok arról számoltak be, hogy éhezést vált ki

A BDNF-mRNS szintjének 50% -os csökkenése a VMH 5, 30, 31 egereknél, ez a reakció várhatóan az étvágy növekedéséhez vezet. Fontos, hogy egy 16 órás böjt után nem találtunk változást a BDNF-ben a VMH-ban. Ezzel a megfigyeléssel összhangban mások azt tapasztalták, hogy a BDNF-átírások nem csökkennek a VMH-ban akár 48 órán keresztül is gyorsan. Az étvágyszabályozás magában foglalja a szabályozó csomópontok átfogó hálózatát, amely lefedi a gyomor-bél traktus különböző szerveit az agy különböző területein 32. A BDNF-t termelő hematopoietikus sejtek viszonylag akut toborzása PVN-hez homoeosztatikus válasz lehet az éhomi stresszre. Bár valószínű, hogy a PVD-ben a BDNF korai növekedése (hematopoietikus sejtkötés révén) előkészítheti az utat a BDNF késleltetett szabályozásához a VMH-ban, a két folyamat közötti pontos kapcsolat további vizsgálatot igényel. Ebben a tanulmányban elsősorban a CRH neuronokat vizsgáltuk. A PVN-ben azonban más neurohormonok, mint például a tirotropint felszabadító hormon, az oxitocin és a szeszfatin, részt vehetnek a táplálkozás és az anyagcsere szabályozásában, és a jövőben további vizsgálatokat érdemelhetnek.

A BDNF vérképző expressziójának az étvágyszabályozásban betöltött alapvető szerepét számos kísérlet erősen alátámasztja, olyan egerek bevonásával, amelyek elvesztették BDNF előállításának képességét (és ezt a képességet helyreállító egerek) kizárólag a BM-ből származó sejtekben. Nemrégiben azt találták, hogy a BM-ből származó hematopoietikus sejtek a hippocampusba vándorolnak, miután egerekben lábgázlódások által kiváltott stressz következett be. Így kimutatták, hogy különböző típusú ingerek vándorolják a BM-ből származó sejteket a központi idegrendszer meghatározott régióiba. Évtizedek óta ismert, hogy a hematopoietikus mononukleáris sejtek BDNF-t termelnek, bár az ilyen erős bioaktív molekulát termelő perifériás sejtek lehetséges funkciója megfoghatatlan. Most, hogy felismerjük, hogy a hematopoietikus sejtek hozzáférhetnek a CNS meghatározott régióihoz, különféle ingerekre reagálva, reméljük, hogy az itt bemutatott eredmények ösztönözni fogják más központi idegrendszeri funkciók felfedezését, amelyeket potenciálisan szabályozhatnak a hematopoietikus sejtek által termelt géntermékek. Végül a könnyen hozzáférhető hematopoietikus sejtek étvágyszabályozásban való részvételének felfedezése új perspektívát adott a patogenezishez, miközben felgyorsíthatja az elhízás, valamint az étvágy diszregulációs szindrómák, például az anorexia nervosa új terápiáinak kidolgozását is. és bulimia.

mód

Állat- és in vivo vizsgálatok

Immunhisztokémia és immunelektron mikroszkópia

Lézeres befogás mikrodisszekció és RNS izolálás

Az RNS-elemzéshez 12 μm vastag fagyasztott szakaszokból szövetmintákat nyertünk minden egyes hipotalamusz sejtmagból vagy 50 befogott GFP-pozitív vagy -negatív sejtből egyetlen CapSure HS LCM Cap-ra (Arcturus Engineering, Mountain View, CA) a következő paraméterek felhasználásával: foltméret = 7,5 μm; teljesítmény = 50–80 mW; és az impulzus időtartama = 50–1 000 μs. Az összes RNS-t PicoPure RNS Isolation Kit (Arcturs) segítségével izoláltuk, és DNáz I-vel (Invitrogen) kezeltük.

Mennyiségi RT - PCR

Kvantitatív RT - PCR-t végeztünk a LightCycler Fast Start DNS Master SYBR Green I Kit és a LightCycler 480 Probe Master (Roche Diagnostics) segítségével. Az egyes reakciók kibocsátott fluoreszcenciáját háromszor mértük az izzítás/meghosszabbítás fázis alatt, és az amplifikációs diagramokat LIGHT CYCLER 480 System II (Roche Diagnostics) alkalmazásával elemeztük. A potenciális genomi DNS-szennyeződést néhány intron-befogadó primer és DNáz-emésztés segítségével ellenőriztük. Az egyes minták relatív értékét a kontrollmintákból kapott standard görbével számítottuk ki, és ezt standardizáltuk, osztva azt a hányadossal elosztva a glicerinaldehid-3-foszfát-dehidrogenáz (GAPDH) ugyanazon kísérlet során egyidejűleg kapott értékével. Az első szálú cDNS-t a későbbi PCR-elemzések során alkalmaztuk. A következő primereket használtuk: BDNF; 5'-upstream primer, 5'-TTGTTTTGTGCCGTTTACCA-3 'és 3' downstream primer, 5'-GGTAAGAGAGCCAGCCACTG-3 ', GAPDH; 5 'upstream primer, 5′-AACGACCCCTTCATTGAC-3' és 3 'downstream primer, 5′-TCCACGACATACTCAGCAC-3'. A PCR-termékek azonosságát méret alapján igazoltuk agarózgél-elektroforézist és nukleotidszekvencia-elemzést követően. A GAPDH mRNS-ből származó jel szolgált belső kontrollként a különböző minták közötti különbségek értékelésére.

DNS mikroarray

Öt különböző GFP-BMT egérből származó GFP-pozitív sejteket vagy öt vad típusú egérből származó teljes PVN-t fogtunk el mind etetett, mind éhomi éhgyomorra (16 óra) LCM segítségével. A mintákat a Bio Matrix Research Laboratory-ba (Japán) küldték, ahol az RNS-mintákat az Agilent 2100 BioAnalyser (Agilent Technologies) és a NanoDrop (NanoDrop Technologies) segítségével ellenőrizték. Az RNS mintákat kétciklusú céljelzéssel amplifikáltuk, biotinilezett cDNS-vé alakítottuk át, és hibridizáltuk az Affymetrix Mouse Genome U34A GeneChip tömbjével (Santa Clara, Kalifornia). A Gene Spring Viewer (Agilent Technologies) segítségével elemeztük az adatokat és kiszámítottuk az expressziós arányt (r = éhgyomorra/táplálékra). Megmutattuk a mikroglia-rokon gének (GFP-pozitív sejtek LCM), valamint a citokinek és gyulladással kapcsolatos gének (a teljes PVN LCM) expresszióját r> 2 és r 21 eredménnyel (S4 kiegészítő táblázat). Az amplifikációt valós idejű PCR-vizsgálatokkal végeztük 5′FAM próbákkal (Sigma Genosys) LIGHT CYCLER 480 System II-n (Roche Diagnostics). A 20 μl-es végső reakciótérfogat 5 μl cDNS-t, 0,5 μM minden primert (forward primer és fordított primer), 0,1 μM 5′FAM szondát és 10 μl LightCycler 480 szondamestert tartalmazott (Roche Diagnostics).

Mononukleáris sejtek intracerebroventrikuláris injekciója

A mononukleáris sejtfrakciót az egér BM-ből izoláltuk Ficoll-Paque PLUS (GE Healthcare) alkalmazásával. Érzéstelenítés után az egerek fejét sztereotaxiás eszközökkel rögzítettük (SR-6, Scientific Instrument Lab., Tokió, Japán). A sejteket a harmadik kamrába injektáltuk egy Hamilton-fecskendőhöz rögzített 30-G tű segítségével, Paxinos és Watson 34 által a tankönyvből kapott koordináták szerint (-0,82 mm-re a bregmától). A sejtszuszpenzió injektált térfogata 5 μl, az egérenként 1 x 106 volt .

Statisztikai analízis

Az eredményeket átlagként ± sd. A statisztikai elemzést az SPSS Statistics 19 szoftverrel végeztük. Két független csoport összehasonlítására a Student t-tesztjét használták, három vagy több csoport összehasonlítására az egyirányú varianciaanalízist vagy az ismételt mértékű varianciaanalízist, majd a többszörös összehasonlító tesztet használták. Statisztikailag szignifikáns különbséget P-értékként határoztak meg